Лаборатория простых систем

Направления исследований

Реконструкция основных биохимических осцилляторов клеточного метаболизма и их использование для создания синтетических клеток

Логотип лаб простых систем.jpg Главной целью данного фундаментального проекта являются ответы на основополагающие вопросы об устройстве и принципах организации живых систем. В нашей работе основным модельным объектом для поиска «коровых» метаболических реакций служит бактерия класса Молликут Mycoplasma gallisepticum. Мы посвятили много лет мульти-«омиксному» изучению данной бактерии, которая по сути представляет собой модель минимальной клетки, в различных пертурбационных моделях.

Полученные результаты позволили сконцентрировать наше внимание на ряде метаболических реакций, способных к осцилляциям. Наиболее значимым и распространенным путем в живой клетке, реакции которого обладают способностью осциллировать, является гликолиз. Влияя на качественный и количественный состав метаболической реакции, можно изменять частоту и амплитуду осцилляций, что способно привести к запуску или остановке «химического сердца» клетки. Выявление таких реакций – ключевая задача для воссоздания искусственной клетки.

Для реализации данного проекта используются как расчетные математические подходы, моделирование, так и практическая работа с модельными бактериальными объектами и in vitro конструирование метаболических путей в липосомах с использованием клеточных экстрактов или рекомбинантных белков.

Помимо фундаментального значения, у данного проекта имеется и прикладное: создание молекулярных машин с известным набором функций и заданными свойствами.

Такие молекулярные машины могут быть использованы в различных целях:

Создание микроорганизмов для продукции или утилизации химических соединений. Существующие микроорганизмы имеют врождённые особенности и ограничения. Например, продуценты химического соединения могут иметь неэффективный метаболизм в условиях производства. Синтезируя микроорганизм заново, можно избежать таких ограничений.
Создание биосенсоров. Синтетическая платформа позволяет конструировать не только целые геномы, но и отдельные функциональные модули. С её помощью можно получать не существующие в природе белки или их каскады. Например, создать искусственную систему записи информации в ДНК по сигналу от некоторого сенсора.

Такие сенсоры можно ввести пациенту или модельному животному, собрать информацию о происходящих процессах, а потом её прочитать.
Создание новых средств доставки терапевтических агентов. Искусственный микроорганизм может быть превращён в средство доставки или даже продукции на месте терапевтических агентов. Для этого искусственный организм лишается, например, способности делиться. Также в его геном добавляются необходимые ферментативные пути.
Конструирование и сборка генов.
Диагностика различных заболеваний человека, животных и растений с помощью биосенсоров.
Создание белковых библиотек для скрининга активности. Часто белки с новыми свойствами, например, ферменты, специфичные к новым субстратам, получают на основе уже существующих.

Изучение роли IgA-опосредованного распознавания патогенных E. сoli для их вирулентности

Одним из представителей микробиоты эукариот является условно-патогенная бактерия Escherichia coli, встречающаяся в относительно небольших количествах, по сравнению с другими симбиотическими бактериями. Однако именно штаммы E. coli могут стать причиной хронических воспалительных заболеваний кишечника, таких как язвенный колит и болезнь Крона. Секреторные антитела класса IgA (sIgA) представляют собой первую линию взаимодействия иммунной системы и бактериальных клеток в просвете кишечника.

Несмотря на то, что структура sIgA считается достаточно изученной, все еще до конца не известен весь спектр функций, которые выполняет самая большая по количеству популяция антител. Хотя отсутствие в организме IgA способно замещаться IgM, у людей, страдающих дефицитом IgA, обнаруживают различные заболевания, связанные с расстройствами желудочно-кишечного тракта, аллергии и аутоиммунные заболевания. Известно, что около 70% микробиома кишечника покрыты секреторными IgA, которые, предполагают, могут распознавать рецептор-связывающие домены патогена, избирательно блокировать определенные факторы вирулентности, препятствовать колонизации патогенов в просвете кишечника и выполнять другие функции. Считается, что sIgA являются главными факторами в поддержании толерантности по отношению к собственной микрофлоре, однако механизмы таких взаимоотношений до сих пор не изучены. Не известно, как именно sIgA отличают собственную микрофлору от чужеродной или патогенной микрофлоры. В связи с этим изучение роли IgA-опосредованного распознавания патогенных E. сoli является чрезвычайно актуальной задачей, это позволит приблизиться к пониманию механизмов влияния IgA на физиологию/вирулентность энтеробактерий с последующей разработкой новых подходов к лечению вызываемых ими заболеваний.

Выяснение роли внутриклеточных патогенов в развитии нейродегенерации

Болезни Паркинсона и Альцгеймера – наиболее распространенные формы деменции. Одним из основных событий, приводящих к нейродегенеративным процессам, является нарушение сборки третичной структуры, агрегация и отложение белков, которые ведут к потере синаптических связей и гибели нейронов. Вовлеченность инфекции мозга (бактериальной, вирусной и грибковой) в патогенез аномального накопления белков подтверждается все большим массивом экспериментальных данных. Различные нейродегенеративные состояния, такие как боковой амиотрофический склероз, множественный склероз, расстройства аутистического спектра, сопровождаются частыми бактериальными инфекциями, и род Mycoplasma – наиболее встречающийся.

В нашей лаборатории проводятся работы по исследованию роли микоплазменной инфекции на активацию и прогрессирование процессов, вовлеченных в развитие нейродегенерации (агрегирование амилоидных пептидов, фосфорилирование и агрегация тау-белка, ферроптоз и т.п.). Определение механизмов развития деструктивных изменений при воздействии инфекционного агента позволит снизить риск развития нейродегенеративных заболеваний и продвинуться в методах лечения уже развившихся нарушений.

Создание отраслевой платформы для оценки протективности антигенов и потенциальных вакцинных препаратов

Наблюдаемая на данный момент эпидемия планетарного масштаба коронавируса SARS-CoV-2 (COVID-19) ясно показала, насколько важным является исследование вирусных и бактериальных сообществ при взаимодействии с их хозяевами, а именно, изучение антигенных структур, приводящих к развитию протективного иммунитета либо, напротив, к нежелательным последствиям, например, к возможным аутоиммунным реакциям.

С самого начала пандемии наш научный коллектив детально изучал иммунный ответ пациентов при COVID-19, а также проводил анализ возможных постковидных осложнений.

В настоящее время нами разрабатывается платформа для создания вакцинных препаратов профилактического и лечебного действия, предназначенная для выявления потенциальных антигенных структур, выработка антител на которые организмом человека будет способствовать осуществлению гуморальной защиты.

Последние 100 лет своего развития инфекционная иммунология имела дело с хорошо охарактеризованными возбудителями инфекционных болезней вирусной или бактериальной этиологии. И даже внезапно возникшей пандемии COVID-19, возбудителем которого является SARS-CoV-2, предшествовали годы подробного изучения гомологичного вируса SARS-CoV. Вместе с тем быстро меняющаяся климатическая и антропогенная сфера нашей планеты не исключает приход новых, еще не изученных возбудителей, для которых не определены антигенные свойства различных молекул, входящих в их состав, и уж тем более, не известны протективные антигены.

Основной целью данного проекта является создание отраслевой платформы для оценки протективности антигенов и потенциальных вакцинных препаратов на эффективность действия B- и T-клеточного звена in vitro и in vivo.

протективность-6.jpg

Используемые методы:

Секвенирование и методы сборки геномных и транскриптомных данных de novo.
Биоинформатический анализ для поиска оптимальных кандидатных белков, которые могут выступать в качестве антигенов.
Методы синтеза потенциальных белков-антигенов.
Аналитические методы, устанавливающие посттрансляционные модификации белков, имеющих антигенные свойства.
Методы биоинформатического анализа, направленные на расчет возможной конформации молекул и их потенциальной роли в формировании у хозяина протективного иммунного ответа, опосредованного B-клеточным (гуморальным) или Т-клеточным звеном иммунитета.
Методы поиска и картирования эпитопов с последующим пептидным их синтезом для подтверждения распознавания их антителами.
Методы конструирования гибридных белков для получения так называемых субъединичных вакцинных прототипов.
Методы анализа и оценки эффективности работы вакцинных прототипов в качестве продукта, который стимулирует иммунную систему (Т- и В-клеточное звено) человека на выработку иммунитета к определенному заболеванию. Исследования будут проводиться как на уровне биоинформатического расчета возможности аминокислотной последовательности быть распознанной HLA I и II типов для последующей презентации, а также с помощью методов ELISpot (для Т-клеточного ответа), ИФА и вестерн-блоттинга для объемных и линейных эпитопов В-клеточного ответа соответственно, анализ процессинга вакцинных прототипов протеасомами и иммунопротеасомами.
Методы поверки существующих вакцинных препаратов на их состав, качество и эффективность (способность активировать Т- и/или В-клеточный иммунитет).

Методы, применяемые в лаборатории

Методы протеомного анализа (одномерный и двумерный гель-электрофорез, гидролитическое расщепление белка, масс-спектрометрия, вестерн-блот, обогащение фракции фосфопептидов).
Методы выделения ДНК, РНК, получение кДНК, методы подбора праймеров.
Методы выделения метаболитов из биологических объектов.
Методы культивирования бактериальных агентов (Mycoplasma gallisepticum, Acholeplasma laidlawii, E. coli), работа с эукариотическими клетками (исследования модели патоген–хозяин).
Методы транскрипционного анализа (ОТ-ПЦР, методы полногеномного и полнотранскриптомного секвенирования).
Микроскопия (световая, флуоресцентная, электронная).
Методы ультрацентрифугирования для выделения клеточных компартментов (рибосом, ядер и нуклеоидов, митохондрий), бактериальных везикул.
Методы формирования искусственных липосом.
Методы математического и биоинформатического моделирования.

Публикации

Шокина ВА, Матюшкина ДС, Кривонос ДВ, Манувера ВА, Широков ДА, Харлампиева ДД, Лазарев ВН, Павленко АВИльина ЕН, Румянцев АГ, Румянцев СА, Иванов КП, Хромова ПА, Баклаушев ВП, Корицкий АВ, Куропаткин ВА, Москалева ЕВ, Огарков ОБ, Орлова ЕА, Петрова АГ, Поженько НС, Пушкарь ДЮ, Колонтарев КБ, Колышкина НА, Рычкова ЛВ, Самойлов АС, Синьков ВВ, Соловьева СВ, Троицкий АВ, Удалов ЮД, Юсубалиева ГМ, Говорун ВМ. Гуморальный иммунный ответ на линейные и конформационные эпитопы SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19. Иммунология 2023, 44 (1): 38-52. DOI: doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-1-38-52
Matyushkina D, Shokina V, Tikhonova P, Manuvera V, Shirokov D, Kharlampieva D, Lazarev V, Varizhuk A, Vedekhina T, Pavlenko A, Penkin L, Arapidi G, Pavlov K, Pushkar D, Kolontarev K, Rumyantsev A, Rumyantsev S, Rychkova L, Govorun V. Autoimmune Effect of Antibodies against the SARS-CoV-2 Nucleoprotein. Viruses 2022, 14, 1141. doi: org/10.3390/v14061141
Fisunov G Yu, Pobeguts OV, Ladygina VG, Zubov AI, Galyamina MA, Kovalchuk SI, Ziganshin RK, Evsyutina DV, Matyushkina DS Butenko, IO, Bukato ON, Veselovsky VA, Semashko TA, Klimina KM, Levina GA, Barhatova OI, Rakovskaya IV. Thymidine utilisation pathway is a novel phenotypic switch of Mycoplasma hominis. J Med Microbiol. 2022; 71(1): 001468. DOI: 10.1099/jmm.0.001468.
Babenko V, Bakhtyev R, Baklaushev V, Balykova L, Bashkirov P, Bespyatykh J, Blagonravova A, Boldyreva D, Fedorov D, Gafurov I, Gaifullina R, Galeeva J, Galova E, Gospodaryk A, Ilina E, K Ivanov, Kharlampieva D, Khromova P, Klimina K, Kolontarev K, Kolyshkina N, Koritsky A, Kuropatkin V, Lazarev V, Manolov A, Manuvera V, Matyushkina D, Morozov M, Moskaleva E, Musarova V, Ogarkov O, Orlova E, Pavlenko A, Petrova A, Pozhenko N, Pushkar D, Rumyantsev A, Rumyantsev S, Rumyantsev V, Rychkova L, Samoilov A, Shirokova I, Sinkov V, Solovieva S, Starikova E, Tikhonova P, Trifonova G, Troitsky A, Tulichev A, Udalov Y, Varizhuk A, Vasiliev A, Vereshchagin R, Veselovsky V, Volnukhin A, Yusubalieva G, Govorun V. Analysis of the upper respiratory tract microbiota in mild and severe COVID-19 patients bioRxiv 2021, 09.20.461025; doi: org/10.1101/2021.09.20.461025.
Matyushkina D, Butenko I, Malyshev N, Govorun V. Mycoplasma as a trigger for the neurodegenerative process development. Published: Jul 2021 in FEBS Open Bio
Arapidi G, Urban A, Shender V, Butenko I, Bukato O, Kuznetsov A, Ivanova O, Lopukhov L, Laikov A, Sharova N, Nikonova M, Mitin A, Martinov A, Grigorieva T, Ilina E, Ivanov V, Govorun V. Identification and analysis of exogenous peptides in human blood serum and plasma: Search for potential agents of interaction between the intestinal microbiota and the human body. The FASEB Journal 2021 https://doi.org/10.1096/fasebj.2021.35.S1.05345.
Koksharova OA, Butenko IO, Govorun VM. beta-N-Methylamino-L-Alanine (BMAA) Causes Severe Stress in Nostoc sp. PCC 7120 Cells under Diazotrophic Conditions: A Proteomic Study. Toxins (Basel) 2021 Apr 30;13(5):325. DOI: 10.3390/toxins13050325.
Petriev VM, Tishchenko VK, Stepchenkova ED, Fedorov OV, Fronya AA. Behavioral Features of Gallium-68 Radionuclide Incorporated in Glucose Derivatives in Laboratory Animals. Bulletin of the Lebedev Physics Institute 2020, Vol. 47, No.11, 339–344
Alekhina OM, Terenin IM, Dmitriev SE, Vassilenko KS. Functional cyclization of eukaryotic mRNAs. Int J Mol Sci. 2020, 21(5), 1677; https://doi.org/10.3390/ijms21051677
Kiseleva AV, Klimushina MV, Sotnikova EA, Divashuk MG, Ershova AI, Skirko OP, Kurilova OV, Zharikova AA, Khlebus EYu, Efimova IA, Pokrovskaya MS, Slominsky PA, Shalnova SA, Meshkov AN, Drapkina OM. A Data-Driven Approach to Carrier Screening for Common Recessive Diseases. J Pers Med. 2020 Sep 22;10(3):140. doi: 10.3390/jpm10030140.
Babenko VV, Podgorny OV, Manuvera VA, Kasianov AS, Manolov AI, Grafskaia EN, Shirokov DA, Kurdyumov AS, Vinogradov DV, Nikitina AS, Kovalchuk SI, Anikanov NA, Butenko IO, Pobeguts OV, Matyushkina DS, Rakitina DV, Kostryukova ES, Zgoda VG, Baskova IP, Trukhan VM, Gelfand MS, Govorun VM, Schiöth HB, Lazarev VN. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches. BMC Genomics 2020 Apr 29;21(1):331. doi: 10.1186/s12864-020-6748-0. Erratum in: BMC Genomics. 2020 Jul 22;21(1):503.
Koksharova OA, Butenko IO, Govorun VM. Proteomic Insights into Starvation of Nitrogen-Replete Cells of Nostoc sp. PCC 7120 under beta-N-Methylamino-L-Alanine (BMAA) Treatment. Toxins (Basel) 2020,12(6), 372; https://doi.org/10.3390/toxins12060372.
Koksharova OA, Butenko IO, Govorun VM. The First Proteomic Study of Nostoc sp. PCC 7120 Exposed to Cyanotoxin BMAA under Nitrogen Starvation. Toxins (Basel) 2020 May 9;12(5):310. doi: 10.3390/toxins12050310.
Fedorov OV, Scherbinina SI, Levin VV, Dilman A D. Light-mediated dual phosphine-/copper-catalyzed atom-transfer radical addition reaction. J Org Chem. 2019, 84(17), 11068–11079.
Kamashev DE, Rakitina TV, Matyushkina DS, Evsyutina DV, Vanyushkina AA, Agapova YuK, Anisimova VE, Drobyshev AL, Butenko IO, Pobeguts OV, Fisunov GY. Proteome of HU-Lacking E. coli Studied by Means of 2D Gel Electrophoresis. Russian Journal of Bioorganic Chemistry 2019, 45: 366–373.
Gao F, Alekhina OM, Vassilenko KS, Simon AE. Unusual dicistronic expression from closely spaced initiation codons in an umbravirus subgenomic RNA. Nucleic Acids Research 2018, 46(22):11726-11742. DOI: 10.1093/nar/gky871.
Rubtsova M, Naraykina Yu, Vasilkova D, Meerson M, Zvereva M, Prassolov V, Lazarev V, Manuvera V, Kovalchuk S, Anikanov N, Butenko I, Pobeguts O, Govorun V, Dontsova O. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research 2018, 46(17): 8966–8977.
Anufrieva KS, Shender VO, Arapidi GP, Pavlyukov MS, Shakhparonov MI, Shnaider PV, Butenko IO, Lagarkova MA, Govorun VM. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of premRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine 2018, 10: 49. https://doi.org/10.1186/s13073-018-0557-y.
Butenko I, Pobeguts O, Matyshkina D, Kovalchuk S, Anikanov N, Fisunov G, Govorun V. Data-independent proteome profile of Mycoplasma gallisepticum under normal conditions and heat stress. Data in Brief 2018, 16, 700-704.
Du Z, Alekhina OM, Vassilenko KS, Simon AE. Concerted action of two 3′ cap-independent translation enhancers increases the competitive strength of translated viral genomes. Nucleic Acids Research. 2017, 45(16), 9558-9572. DOI: 10.1093/nar/gkx643.
Fedorov O V, Struchkova MI, Dilman AD. Synthesis of gem-Difluorinated Hydroxypyrrolidines. J Org Chem. 2017, 82 (6), 3270–3275.
Scherbinina SI, Fedorov OV, Levin VV., Kokorekin VA, Struchkova MI, Dilman AD. Synthesis of 3-Fluoropyridines via Photoredox-Mediated Coupling of α,α-Difluoro-βiodoketones with Silyl Enol Ethers. J Org Chem. 2017, 82 (24), 12967–12974.
Matyushkina DS, Butenko IO, Pobeguts OV, Fisunov GY, Govorun VM. Proteomic response of bacteria during the interaction with a host cell in a model of Mycoplasma gallisepticum. Russian Journal of Bioorganic Chemistry 2017, 43, 531–539.
Fisunov GY, Evsyutina DV, Garanina IA, Arzamasov AA, Butenko IO, Altukhov IA, Nikitina AS, Govorun VM. Ribosome profiling reveals an adaptation strategy of reduced bacterium to acute stress. Biochimie 2017, 132, 66-74.
Butenko I, Vanyushkina A, Pobeguts O, Matyushkina D, Kovalchuk S, Gorbachev A, Anikanov N, Fisunov G, Govorun V. Response induced in Mycoplasma gallisepticum under heat shock might be relevant to infection process. Sci Rep. 2017б 7(1):11330. doi: 10.1038/s41598-017-09237-7.
Fedorov OV, Struchkova MI, Dilman AD. Silicon Reagent with Functionalized Tetrafluoroethylene Fragments: Preparation and Coupling with Aldehydes. J Org Chem. 2016, 81, 9455–9460.
Fedorov OV, Levin VV, Volodin AD, Struchkova MI, Korlyukov AA, Dilman AD. Synthesis of difluorosubstituted six-membered nitronates via an addition/substitution cascade. Tetrahedron Letters 2016, 5, 3639–3642;
Mamaeva EV, Galach’yants YP, Khabudaev KV, Petrova DP, Pogodaeva TV, Khodzher TB, Zemskaya TI. Metagenomic analysis of microbial communities of the sediments of the Kara Sea shelf and the Yenisei Bay. Microbiology 2016, 85(2), 220-230.
Ischenko D, Alexeev D, Shitikov E, Kanygina A, Malakhova M, Kostryukova E, Larin A, Kovalchuk S, Pobeguts O, Butenko I, Anikanov N, Altukhov I, Ilina E, Govorun V. Large scale analysis of amino acid substitutions in bacterial proteomics. BMC Bioinformatics 2016
Matyushkina D, Pobeguts O, Vanyushkina A, Anikanov N, Bukato O, Evsyutina D, Bogomazova A, Lagarkova M, Semashko T, Garanina I, Babenko V, Vakhitova V, Fisunov G, Govorun V. Phase Transition of the Bacterium upon Invasion of a Host Cell as a Mechanism of Adaptation: a Mycoplasma gallisepticum Model. Sci Rep. 2016; 6: 35959.
Bespyatykh J, Shitikov E, Butenko I, Altukhov I, Alexeev D, Mokrousov I, Dogonadze M, Zhuravlev V, Yablonsky P, Ilina E, Govorun V. Proteome analysis of the Mycobacterium tuberculosis Beijing B0/W148 cluster. Sci Rep. 2016; 6: 28985.
Fedorov OV, Kosobokov MD, Levin VV, Struchkova MI, Dilman AD. Halogenative Difluorohomologation of Ketones. J Org Chem. 2015, 80, 5870–5876
Fisunov GY, Evsyutina DV, Arzamasov AA, Butenko IO, Govorun VM. Profiling of Mycoplasma gallisepticum Ribosomes Acta Naturae 2015, 7 (4), 107-112.
Khabudaev KV, Petrova DP, Grachev MA, Likhoshway YV. A new subfamily LIP of the major intrinsic proteins. BMC Genomics 2014, 15(1), 1-7.
Shender VO, Pavlyukov MS, Ziganshin RH, Arapidi GP, Kovalchuk SI, Anikanov NA, Altukhov IA, Alexeev DG, Butenko IO, Shavarda AL, Khomyakova EB, Evtushenko E, Ashrafyan LA, Antonova IB, Kuznetcov IN, Gorbachev AYu, Shakhparonov MI, Govorun VM. Proteome-Metabolome Profiling of Ovarian Cancer Ascites Reveals Novel Components Involved in Intercellular Communication. Molecular & Cellular Proteomics 2014.
Alekhina OM, Vassilenko KS. Translation initiation in eukaryotes: versatility of the scanning model. Biochemistry (Moscow) 2012 Dec;77(13):1465-77. doi: 10.1134/S0006297912130056.
Shenkarev ZO, Lyukmanova EN, Butenko IO, Petrovskaya LE, Paramonov AS, Shulepko MA, Nekrasova OV, Kirpichnikov MP, Arseniev AS. Lipid-protein nanodiscs promote in vitro folding of transmembrane domains of multi-helical and multimeric membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes 2013, 1828 (2) 776-784.
Alekhina OM, Vassilenko KS, Spirin AS. Translation of non-capped mRNAs in a eukaryotic cell-free system: acceleration of initiation rate in the course of polysome formation. Nucleic Acids Research 2007, 35(19), 6547-6559. DOI: 10.1093/nar/gkm725.
Shirokikh NE, Alkalaeva EZ, Vassilenko KS, Afonina ZA, Alekhina OM, Kisselev LL, Spirin AS. Quantitative analysis of ribosome–mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research 2009, 38(3), e15-e15. DOI: 10.1093/nar/gkp1025
Vassilenko KS, Alekhina OM, Dmitriev SE, Shatsky IN, Spirin AS. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research 2011, 39(13), 5555-5567. DOI:10.1093/nar/gkr147