Реконструкция основных биохимических осцилляторов клеточного метаболизма и их использование для создания синтетических клеток
Главной целью данного фундаментального проекта являются ответы на основополагающие вопросы об устройстве и принципах организации живых систем. В нашей работе основным модельным объектом для поиска «коровых» метаболических реакций служит бактерия класса Молликут Mycoplasma gallisepticum. Мы посвятили много лет мульти-«омиксному» изучению данной бактерии, которая по сути представляет собой модель минимальной клетки, в различных пертурбационных моделях.
Полученные результаты позволили сконцентрировать наше внимание на ряде метаболических реакций, способных к осцилляциям. Наиболее значимым и распространенным путем в живой клетке, реакции которого обладают способностью осциллировать, является гликолиз. Влияя на качественный и количественный состав метаболической реакции, можно изменять частоту и амплитуду осцилляций, что способно привести к запуску или остановке «химического сердца» клетки. Выявление таких реакций – ключевая задача для воссоздания искусственной клетки.
Для реализации данного проекта используются как расчетные математические подходы, моделирование, так и практическая работа с модельными бактериальными объектами и in vitro конструирование метаболических путей в липосомах с использованием клеточных экстрактов или рекомбинантных белков.
Помимо фундаментального значения, у данного проекта имеется и прикладное: создание молекулярных машин с известным набором функций и заданными свойствами.
Такие молекулярные машины могут быть использованы в различных целях:
Создание микроорганизмов для продукции или утилизации химических соединений. Существующие микроорганизмы имеют врождённые особенности и ограничения. Например, продуценты химического соединения могут иметь неэффективный метаболизм в условиях производства. Синтезируя микроорганизм заново, можно избежать таких ограничений.
Создание биосенсоров. Синтетическая платформа позволяет конструировать не только целые геномы, но и отдельные функциональные модули. С её помощью можно получать не существующие в природе белки или их каскады. Например, создать искусственную систему записи информации в ДНК по сигналу от некоторого сенсора.
Такие сенсоры можно ввести пациенту или модельному животному, собрать информацию о происходящих процессах, а потом её прочитать.
Создание новых средств доставки терапевтических агентов. Искусственный микроорганизм может быть превращён в средство доставки или даже продукции на месте терапевтических агентов. Для этого искусственный организм лишается, например, способности делиться. Также в его геном добавляются необходимые ферментативные пути.
Конструирование и сборка генов.
Диагностика различных заболеваний человека, животных и растений с помощью биосенсоров.
Создание белковых библиотек для скрининга активности. Часто белки с новыми свойствами, например, ферменты, специфичные к новым субстратам, получают на основе уже существующих.
Изучение роли IgA-опосредованного распознавания патогенных E. сoli для их вирулентности
Одним из представителей микробиоты эукариот является условно-патогенная бактерия Escherichia coli, встречающаяся в относительно небольших количествах, по сравнению с другими симбиотическими бактериями. Однако именно штаммы E. coli могут стать причиной хронических воспалительных заболеваний кишечника, таких как язвенный колит и болезнь Крона. Секреторные антитела класса IgA (sIgA) представляют собой первую линию взаимодействия иммунной системы и бактериальных клеток в просвете кишечника.
Несмотря на то, что структура sIgA считается достаточно изученной, все еще до конца не известен весь спектр функций, которые выполняет самая большая по количеству популяция антител. Хотя отсутствие в организме IgA способно замещаться IgM, у людей, страдающих дефицитом IgA, обнаруживают различные заболевания, связанные с расстройствами желудочно-кишечного тракта, аллергии и аутоиммунные заболевания. Известно, что около 70% микробиома кишечника покрыты секреторными IgA, которые, предполагают, могут распознавать рецептор-связывающие домены патогена, избирательно блокировать определенные факторы вирулентности, препятствовать колонизации патогенов в просвете кишечника и выполнять другие функции. Считается, что sIgA являются главными факторами в поддержании толерантности по отношению к собственной микрофлоре, однако механизмы таких взаимоотношений до сих пор не изучены. Не известно, как именно sIgA отличают собственную микрофлору от чужеродной или патогенной микрофлоры. В связи с этим изучение роли IgA-опосредованного распознавания патогенных E. сoli является чрезвычайно актуальной задачей, это позволит приблизиться к пониманию механизмов влияния IgA на физиологию/вирулентность энтеробактерий с последующей разработкой новых подходов к лечению вызываемых ими заболеваний.
Выяснение роли внутриклеточных патогенов в развитии нейродегенерации
Болезни Паркинсона и Альцгеймера – наиболее распространенные формы деменции. Одним из основных событий, приводящих к нейродегенеративным процессам, является нарушение сборки третичной структуры, агрегация и отложение белков, которые ведут к потере синаптических связей и гибели нейронов. Вовлеченность инфекции мозга (бактериальной, вирусной и грибковой) в патогенез аномального накопления белков подтверждается все большим массивом экспериментальных данных. Различные нейродегенеративные состояния, такие как боковой амиотрофический склероз, множественный склероз, расстройства аутистического спектра, сопровождаются частыми бактериальными инфекциями, и род Mycoplasma – наиболее встречающийся.
В нашей лаборатории проводятся работы по исследованию роли микоплазменной инфекции на активацию и прогрессирование процессов, вовлеченных в развитие нейродегенерации (агрегирование амилоидных пептидов, фосфорилирование и агрегация тау-белка, ферроптоз и т.п.). Определение механизмов развития деструктивных изменений при воздействии инфекционного агента позволит снизить риск развития нейродегенеративных заболеваний и продвинуться в методах лечения уже развившихся нарушений.
Создание отраслевой платформы для оценки протективности антигенов и потенциальных вакцинных препаратов
Наблюдаемая на данный момент эпидемия планетарного масштаба коронавируса SARS-CoV-2 (COVID-19) ясно показала, насколько важным является исследование вирусных и бактериальных сообществ при взаимодействии с их хозяевами, а именно, изучение антигенных структур, приводящих к развитию протективного иммунитета либо, напротив, к нежелательным последствиям, например, к возможным аутоиммунным реакциям.
С самого начала пандемии наш научный коллектив детально изучал иммунный ответ пациентов при COVID-19, а также проводил анализ возможных постковидных осложнений.
В настоящее время нами разрабатывается платформа для создания вакцинных препаратов профилактического и лечебного действия, предназначенная для выявления потенциальных антигенных структур, выработка антител на которые организмом человека будет способствовать осуществлению гуморальной защиты.
Последние 100 лет своего развития инфекционная иммунология имела дело с хорошо охарактеризованными возбудителями инфекционных болезней вирусной или бактериальной этиологии. И даже внезапно возникшей пандемии COVID-19, возбудителем которого является SARS-CoV-2, предшествовали годы подробного изучения гомологичного вируса SARS-CoV. Вместе с тем быстро меняющаяся климатическая и антропогенная сфера нашей планеты не исключает приход новых, еще не изученных возбудителей, для которых не определены антигенные свойства различных молекул, входящих в их состав, и уж тем более, не известны протективные антигены.
Основной целью данного проекта является создание отраслевой платформы для оценки протективности антигенов и потенциальных вакцинных препаратов на эффективность действия B- и T-клеточного звена in vitro и in vivo.
Используемые методы:
Секвенирование и методы сборки геномных и транскриптомных данных de novo.
Биоинформатический анализ для поиска оптимальных кандидатных белков, которые могут выступать в качестве антигенов.
Методы синтеза потенциальных белков-антигенов.
Аналитические методы, устанавливающие посттрансляционные модификации белков, имеющих антигенные свойства.
Методы биоинформатического анализа, направленные на расчет возможной конформации молекул и их потенциальной роли в формировании у хозяина протективного иммунного ответа, опосредованного B-клеточным (гуморальным) или Т-клеточным звеном иммунитета.
Методы поиска и картирования эпитопов с последующим пептидным их синтезом для подтверждения распознавания их антителами.
Методы конструирования гибридных белков для получения так называемых субъединичных вакцинных прототипов.
Методы анализа и оценки эффективности работы вакцинных прототипов в качестве продукта, который стимулирует иммунную систему (Т- и В-клеточное звено) человека на выработку иммунитета к определенному заболеванию. Исследования будут проводиться как на уровне биоинформатического расчета возможности аминокислотной последовательности быть распознанной HLA I и II типов для последующей презентации, а также с помощью методов ELISpot (для Т-клеточного ответа), ИФА и вестерн-блоттинга для объемных и линейных эпитопов В-клеточного ответа соответственно, анализ процессинга вакцинных прототипов протеасомами и иммунопротеасомами.
Методы поверки существующих вакцинных препаратов на их состав, качество и эффективность (способность активировать Т- и/или В-клеточный иммунитет).
Методы, применяемые в лаборатории
Методы протеомного анализа (одномерный и двумерный гель-электрофорез, гидролитическое расщепление белка, масс-спектрометрия, вестерн-блот, обогащение фракции фосфопептидов).
Методы выделения ДНК, РНК, получение кДНК, методы подбора праймеров.
Методы выделения метаболитов из биологических объектов.
Методы культивирования бактериальных агентов (Mycoplasma gallisepticum, Acholeplasma laidlawii, E. coli), работа с эукариотическими клетками (исследования модели патоген–хозяин).
Методы транскрипционного анализа (ОТ-ПЦР, методы полногеномного и полнотранскриптомного секвенирования).
Matyushkina D, Shokina V, Tikhonova P, Manuvera V, Shirokov D, Kharlampieva D, Lazarev V, Varizhuk A, Vedekhina T, Pavlenko A, Penkin L, Arapidi G, Pavlov K, Pushkar D, Kolontarev K, Rumyantsev A, Rumyantsev S, Rychkova L, Govorun V. Autoimmune Effect of Antibodies against the SARS-CoV-2 Nucleoprotein. Viruses 2022, 14, 1141. doi: org/10.3390/v14061141
Fisunov G Yu, Pobeguts OV, Ladygina VG, Zubov AI, Galyamina MA, Kovalchuk SI, Ziganshin RK, Evsyutina DV, Matyushkina DS Butenko, IO, Bukato ON, Veselovsky VA, Semashko TA, Klimina KM, Levina GA, Barhatova OI, Rakovskaya IV. Thymidine utilisation pathway is a novel phenotypic switch of Mycoplasma hominis. J Med Microbiol. 2022; 71(1): 001468. DOI: 10.1099/jmm.0.001468.
Babenko V, Bakhtyev R, Baklaushev V, Balykova L, Bashkirov P, Bespyatykh J, Blagonravova A, Boldyreva D, Fedorov D, Gafurov I, Gaifullina R, Galeeva J, Galova E, Gospodaryk A, Ilina E, K Ivanov, Kharlampieva D, Khromova P, Klimina K, Kolontarev K, Kolyshkina N, Koritsky A, Kuropatkin V, Lazarev V, Manolov A, Manuvera V, Matyushkina D, Morozov M, Moskaleva E, Musarova V, Ogarkov O, Orlova E, Pavlenko A, Petrova A, Pozhenko N, Pushkar D, Rumyantsev A, Rumyantsev S, Rumyantsev V, Rychkova L, Samoilov A, Shirokova I, Sinkov V, Solovieva S, Starikova E, Tikhonova P, Trifonova G, Troitsky A, Tulichev A, Udalov Y, Varizhuk A, Vasiliev A, Vereshchagin R, Veselovsky V, Volnukhin A, Yusubalieva G, Govorun V. Analysis of the upper respiratory tract microbiota in mild and severe COVID-19 patientsbioRxiv 2021, 09.20.461025; doi: org/10.1101/2021.09.20.461025.