Лаборатория биоэлектрохимии

Наномеханика липидного бислоя в процессах его топологической перестройки (деление и слияние биологических мембран) в норме и при патологии

За деление/слияние клеточных мембран отвечают специализированные белки, чья функциональная активность сводится к созданию сильно искривленных мембранных структур, в которых, по неизвестной пока причине, происходит дестабилизация липидного бислоя и последующая его реорганизация – объединение двух бислоев в один или разделение одного на два. При этом крайне важно сохранение барьерных свойств липидного бислоя. Предполагается, что именно формирование проводящих дефектов в мембранах при их большой изгибной деформации, в том числе во время слияния и деления, может быть причиной возникновения или развития клеточных патологий, которые в конечном итоге приводят к различным заболеваниям. Нормализация процессов топологической перестройки мембран может являться одним из способов борьбы с такими заболеваниями. И, наоборот, противодействие нормальной работе вирусных белков слияния – путь к предотвращению инфицирования клетки оболочечными вирусами (вирусы гепатитов В и С, вирусы гриппа, коронавирусы). 

Наше понимание принципов работы и эволюционного развития белков, специализирующихся на перестройке мембран, равно как и причин патологий, ассоциированных с нарушением работы этих белков или нарушением липидного гомеостаза, невозможно без количественного знания о пределе устойчивости/прочности липидного бислоя при изгибе, о характере его упругости при экстремальных значениях его геометрической кривизны, без представлений о молекулярных механизмах, ведущих к потере им структурной стабильности, и роли липидного состава в этом процессе. Для оценки изгибной прочности липидного бислоя мы разрабатываем тест-систему, основанную на электрофизиологических измерениях, выявляем физические факторы, которые индуцируют потерю его структурной устойчивости при изгибе, и молекулярные пути его последующей топологической реорганизации и стараемся определить роль липидного состава и ионного окружения в данном процессе. В качестве модели мембраны с сильной изгибной деформацией нами используются мембранные нанотрубки, вытягиваемые из липидных бислоев методами пэтч-клампа.  

Помимо экспериментальных методов исследования механики мембраны при ее экстремальных деформациях, нами используются теоретические модели, разрабатываемые в рамках теории упругости сплошных сред и термодинамики мембран, а также подходы молекулярной динамики.

Роль амфипатических липидов в морфогенезе биологических мембран

Изменение формы клеточной мембраны играет важную роль в различных биологических процессах, таких как деление клеток и органелл, передача сигнала, а также внутри- и межклеточный транспорт. Одним из способов изменения формы мембран является образование трубок, цилиндрических структур, выступающих из поверхности мембраны. Такие трубки вместе с так называемыми цистернами (уплощенными мешочками) формируют сложную транспортную сеть в эндоплазматическом ретикулуме, в которой происходит синтез, фолдинг и транспорт белков и липидов, что обеспечивает коммуникацию между его различными частями. Также тубуляция мембран может наблюдаться и при эндоцитозе, где она играет жизненно важную роль в поглощении внеклеточных частиц и рециркуляции мембранных компонентов. 

На сегодня установлено достаточно много механизмов, которые клетка использует для изменения формы мембраны, в частности, для образования мембранных трубок. Одним из них является взаимодействие мембраны со специализированными периферийными белками, чья функция заключается в распознавании и генерации изгибных деформаций липидного бислоя – жидкокристаллического матрикса любой клеточной мембраны. Этот процесс ассоциировали со связыванием амфифильных спиралей (AC) – белковых или пептидных сегментов, у которых гидрофобные и гидрофильные аминокислоты расположены на противоположной поверхности спирали. Используя методы электрофизиологии (измерение ионной проводимости мембранных структур), атомно-силовой микроскопии и флуоресцентной микроскопии (конфокальная микроскопия, TIRF), мы исследуем, как амфифильные пептиды различных периферийных белков и белков вирусного слияния изменяют механические и геометрических параметры липидного бислоя, а также пытаемся определить, какова роль этих изменений в создании сильно искривленных мембранных структур в норме и патологии.

Разработка экспериментальной платформы для поиска антибиотиков нового поколения к лекарственно-устойчивому золотистому стафилококку

В рамках данного проекта создается суперпродуцент РНК полимеразы S. aureus на базе E. coli. Получение большого количества РНК полимеразы S. aureus необходимо для кристаллизации этого белка и решения его трёхмерной структуры с помощью рентгеноструктурного анализа. Данная система позволит получать комплексы РНК полимеразы S. aureus с низкомолекулярными соединениями, обладающими антимикробной активностью. Решение трёхмерных структур таких комплексов позволит осуществлять направленную разработку высокоспецифичных антибиотиков нового поколения, активных в отношении золотистого стафилококка и родственных бактериальных патогенов.

Исследование механизмов транскрипционного мутагенеза у эукариот

Мутации, связанные с включением РНК полимеразой неправильных нуклеозидов, с некоторой частотой встречаются во всех клеточных РНК. Частота таких ошибок считается невысокой для общего пула РНК, однако для некоторых клеточных РНК доля молекул с мутациями может быть значительной. Известно, что точность транскрипции варьирует в зависимости от последовательности транскрибируемой ДНК и физиологического состояния клетки. Повышенная частота транскрипционных мутаций наблюдается при старении и, по крайней мере, при некоторых видах рака. Повышенная частота транскрипционного мутагенеза ведет к развитию протеотоксического стресса в клетке и снижению её жизнеспособности. Молекулярный механизм мутагенеза при транскрипции последовательностей ДНК, где его частота наиболее высока, в настоящее время неизвестен. Использование методов криоэлектронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа позволит определить структурную основу транскрипционного мутагенеза. Это, в свою очередь, даст возможность изучить роль транскрипционного мутагенеза в клетках животных путём регуляции его интенсивности. 

Создание сенсорных клеточных тест-систем in vitro

Актуальность направления по созданию сенсорных клеточных систем связана с поиском новых моделей скрининга различных химических соединений – потенциальных лекарственных средств против коронавирусов SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2, вызывающих тяжелые респираторные инфекции. Свойство гипервариабельности RBD-домена S-белка коронавируса позволяет вирусу уходить от иммунного ответа, вызываемого старыми вариантами вакцин, что делает актуальным поиск новых мишеней для воздействия на вирус. Такой мишенью может стать 3CL-протеаза вируса, поскольку, с одной стороны, работа данного фермента критически важна для жизненного цикла вируса, а с другой – данный белок весьма консервативен для всего семейства коронавирусов. 

Разрабатываемые нами сенсорные клеточные системы, основанные на технологии химерных флуоресцентных белковых меток, будут способны количественно распознавать корректную работу 3CL-протеазы коронавируса SARS-CoV-2. Это позволит нам применять данную модель для решения нескольких научных задач, например, для скрининга низкомолекулярных веществ-ингибиторов или создания эукариотического дисплея поиска однодоменных антител, ингибирующих действие протеазы.

Разработка методов молекулярно-генетической диагностики и контроля саногенеза здоровых людей

Гомеостаз представляет собой сложный динамический процесс, который происходит на всех структурных и функциональных уровнях организма, в различных органах и тканях, обеспечивающий жизнедеятельность организма и выполнение многочисленных функций, необходимых для нормальных биологических и продуктивных взаимоотношений с окружающей средой. Организм постоянно подвергается патогенным воздействиям, вызывающим патологические изменения в тканях, различные по степени и форме. Однако эти изменения устраняются защитными саногенетическими механизмами, предотвращающими трансформацию локальной патологии в болезнь. Патологический процесс трансформируется в болезнь только тогда, когда механизмы саногенеза становятся нарушенными или недостаточными и организм не может функционировать в необходимой и оптимальной степени. 

В качестве меры уровня саногенеза здорового человека возможно использование физиологической устойчивости организма, измеряемого как скорость восстановления после возмущающего патогенного воздействия [Gijzel SMW et al. J Am Geriatr Soc. 2019; Whitson HE et al. J Gerontol Series A: Biomed Sci Med Sci. 2015]. Установлена связь физиологической устойчивости и смертности [Olde Rikkert Marcel GM et al. Crit Care Med. 2016]. Таким образом, изменения ее показателей могут служить ранним предупреждающим признаком надвигающихся последствий для здоровья. Следовательно, для рационального проектирования, разработки и проверки эффективных мер здоровьесбережения необходимо лучшее количественное понимание сложной взаимосвязи между медленной динамикой физиологического состояния, устойчивостью и экспоненциальным ускорением заболеваемости с возрастом и смертностью. Для этого требуется разработка методов оценки физиологической устойчивости организма здорового человека.

Данная задача решается нами в рамках государственного задания «Разработка методов молекулярно-генетической диагностики и контроля саногенеза здоровых людей». Нами начато лонгитюдное исследование – наблюдения за изменениями специально отобранного набора молекулярно-генетических маркеров и физиологических показателей здоровья и частотой заболеваемости среди жителей Российской Федерации. Для этого мы используем метод оценки физиологической устойчивости, основанный на ранее разработанной статистической модели [Pyrkov TV et al, Nat Comm. 2021]. 

На основе большой базы данных результатов общего анализа крови с использованием методов машинного обучения нам удалось выделить динамический индикатор состояния организма (ДИСО), показатель которого коррелирует с возрастом и количеством хронических заболеваний человека. Мы используем аналогичный подход, применяя его к базе данных общего клинического анализа крови человека, полученных в период с 2016 года по настоящее время в различных географических областях РФ. Проводится исследование корреляции ДИСО с развитием эпидемии, вызванной COVID-19, а также ее влияния на здоровье населения Российской Федерации.