Разработка нелинейных нанофлюидных устройств для детектирования одиночных молекул и определения их свойств
Нанофлюидика — это быстро развивающиеся направление науки, которое изучает физику жидкости и ее течения в условиях ограничения наноразмерными структурами, такими как нанотрубки или наноканалы. Нанотрубки – тонкие цилиндры, чья стенка представляет собой пленку толщиной от нескольких молекулярных слоев до атомарного. Они являются общим элементом нанофлюидных систем, предназначенных для осуществления управления переносом вещества на нанометровых масштабах, например, для контроля химических реакций или идентификации и изучения одиночных макромолекул. Заполненные электролитом нанотрубки, диаметр которых сравним с характерной длиной экранирования Дебая, становятся электропроводящими структурами с сильно выраженными нелинейными электрическими свойствами. Это позволяет осуществлять электростатический контроль (отпирание-запирание) переноса ионов через просвет нанотрубки. Таким образом на базе таких структур становится возможным формирование жидкостных диодов, транзисторов и логических схем.
До настоящего времени возможности электростатического запирания-отпирания, управления ионной селективностью и переносом вещества исследовались и реализовывались на основе твердотельных нанотрубок и нанопор с использованием внешнего или собственного (заданного поверхностным зарядом) электрического поля, которое модулировало как концентрацию ионов в просвете структуры, так и напряженность электрического поля в нем. Изобретение и распространение новых технологий получения наноструктур и модификации их поверхности за последние годы серьезно расширили спектр материалов для разработки нанофлюидных структур с заданными свойствами. Однако все они имеют ряд общих недостатков – значительный разброс физико-химических свойств внутренней поверхности наноканала и ограниченная возможность их гибкой подстройки после формирования. Что сильно затрудняет их использования в области медицины и клинической диагностики для разработки устройств селективного обнаружения биомаркеров, или интерактивных нанодозаторов лекарственных препаратов, обеспечивающих поддержание действующей концентрации в заданном диапазоне.
Мы предлагаем принципиально новый подход к механизму управления проводящими (транспортными) характеристиками наноканала, основанный на сопряжении формы и поверхностного заряда эластичной нанотрубки с градиентами электрического поля вдоль и через стенку канала. Эластичная нанотрубка радиусом в несколько нанометров формируется из липидного бислоя, что обеспечивает ее высокую био-совместимость. А жидкокристаллическая природа липидного бислоя позволяет формировать на его основе нанофлюидные структуры с динамически контролируемыми и пространственно-неоднородными физико-химическими параметрами, используя природное многообразие свойств липидных молекул (геометрия, заряд, реакционная способность и т.д.). Управляемое перераспределение липидных молекул вдоль канала обеспечивается сочетанием двух факторов – изгибный стресс (перераспределение молекул липидов различной формы в градиенте кривизны мембраны) и электрический потенциал (перераспределение заряженных молекул).
Мы работаем над созданием прототипа нанофлюидного полевого транзистора из эластичного материала (липидного бислоя) и изучение механизмов его управления (отпирание-запирание). Недавно мы продемонстрировали, что липидные нанотрубки позволяют разрешать адсорбцию одиночных белковых комплексов в режиме квазилинейной проводимости.
В транзисторном режиме мы ожидаем достижения значительно более высокой чувствительности и селективности, основанной на различиях электростатического взаимодействия между молекулой и упругой стенкой канала. Очевидно, что появление таких контрольно-измерительных устройств даст мощнейший импульс к развитию “персонализированной медицины” и диагностики большого количества патологий, созданию устройств типа лаборатория-на-чипе.
Разработка методов молекулярно-генетической диагностики и контроля саногенеза здоровых людей
Современная медицинская практика носит реактивный характер. Ежегодные осмотры измеряют лишь несколько основных фенотипов и часто не могут предсказать возникновение серьезных угроз здоровью, таких как рак, слабоумие или воздействие патогенов. Вместо этого большинство заболеваний не выявляется до появления критических симптомов, что часто бывает слишком поздно для значимого или экономически эффективного медицинского вмешательства. Из-за недостатка данных нынешняя модель здравоохранения носит периодический характер и направлена на устранение симптомов заболевания в самом начале, а не на предотвращение или устранение основной этиологии. Cовременная медицина будет по-настоящему эффективной только тогда, когда она перейдет от реактивного лечения заболеваний к системе, построенной по правилу четырех “P” «предиктивность, превентивность, персонификация и взаимодействие». Чтобы совместить доступность носимых устройств с надежностью и качеством клинической медицины, необходим третий вариант, который обеспечит количественное измерение здоровья и механистическое понимание происхождения и прогрессирования заболеваний, а также позволит оценивать комплекс защитно-приспособительных механизмов, направленный на восстановление нарушенной саморегуляции организма, – саногенеза.
Гомеостаз представляет собой сложный динамический процесс, происходящий на всех структурных и функциональных уровнях организма и в различных органах и тканях для обеспечения жизнедеятельности организма и выполнения многочисленных функций, необходимых для нормальных биологических и продуктивных взаимоотношений с окружающей средой. Организм постоянно подвергается патогенным воздействиям, вызывающим патологические изменения в тканях, различные по степени и форме. Однако эти изменения устраняются защитными саногенетическими механизмами, предотвращающими трансформацию локальной патологии в болезнь. Патологический процесс трансформируется в болезнь только тогда, когда механизмы саногенеза становятся нарушенными или не достаточными, и организм не может функционировать в необходимой и оптимальной степени. В качестве меры уровня саногенеза здорового человека возможно использование физиологической устойчивости его организма, измеряемого как скорость восстановления после возмущающего патогенного воздействия [Gijzel, S. M. W. et al., J. Am. Geriatr. Soc. 2019; Whitson, H. E. et al., J. Gerontol. Series A: Biomed. Sci. Med. Sci. 2015.]. Установлена связь физиологической устойчивости и смертности [GM, O. R. et al. Crit. Care Med. 2016], таким образом, изменения ее показателей могут служить ранним предупреждающим признаком надвигающихся последствий для здоровья. Следовательно, для рационального проектирования, разработки и проверки эффективных мер здоровьесбережения необходимо лучшее количественное понимание сложной взаимосвязи между медленной динамикой физиологического состояния, устойчивостью и экспоненциальным ускорением заболеваемости с возрастом и смертности. Для этого требуется разработка методов оценки физиологической устойчивости организма здорового человека.
Мы предполагаем, что признаки здоровья — это не просто индикаторы жизненной силы, а, скорее, причинно связаны с поддержанием его гомеостаза. Нормальное состояние гомеостаза человека может быть представлено в виде набора измеримых вариативных параметров, изменение которых в допустимых пределах «индивидуальной нормы» не представляет опасности для здоровья. При длительном наблюдении за широким спектром параметров, включая физиологические и биохимические показатели, возможно методами статистического анализа выделить драйверные параметры, модулирующие изменение целой группы показателей «индивидуальной нормы».
Данная задача решается нами в рамках государственного задания «Разработка методов молекулярно-генетической диагностики и контроля саногенеза здоровых людей». Нами начато лонгитюдное исследование – наблюдения за изменениями специально отобранного набора молекулярно-генетических маркеров, клеточного скрининга, физиологических показателей здоровья и частотой заболеваемости здоровых добровольцев. Кроме того мы также планируем использовать метод оценки физиологической устойчивости [Pyrkov T.V. et al, Nat Comm 2021]. На основе большой базы данных результатов общего анализа крови, используя методы машинного обучения, удалось выделить динамический индикатор состояния организма, показатель которого коррелировал с возрастом и количеством хронических заболеваний человека. Мы используем аналогичный подход, применяя его к базе данных общего клинического анализа крови человека, полученных в период с 2016 по настоящее время в не менее трех различных географических областях РФ.
Наномеханика липидного бислоя в процессах его топологической перестройки (деление и слияние биологических мембран) в норме и при патологии и липид-белковые взаимодействия, ответственные за морфогенез биологических мембран
Установлено, что целый ряд патологий, таких как болезнь Шарко-Мари-Тута, мальабсорбция, различные нейро- и миопатии, шизофрения, болезнь Альцгеймера, болезнь Гентингтона связаны с нарушениями деления и слияния мембранных компартментов в различных процессах, включая эндоцитоз, внутриклеточный транспорт, деление органелл, слияние синаптических пузырьков. В некоторых случаях это видно в образовании органелл и компартментов неправильной формы и с дефектными функциями. За деление/слияние мембран отвечают специализированные белки, чья функциональная активность сводится к созданию сильно искривленных мембранных структур, в которых, по неизвестной пока причине, происходит дестабилизация липидного бислоя и последующая его реорганизация – объединение двух бислоев в один, или, разделение одного на два. При этом крайне важно сохранение барьерных свойств липидного бислоя. Предполагается, что именно формирование проводящих дефектов в мембранах при их большой изгибной деформации, в том числе во время слияния и деления, может быть причиной возникновения или развития патологии. Нормализация процессов топологической перестройки мембран может являться одним из способов борьбы с вышеуказанными заболеваниями. И, наоборот, противодействие нормальной работе вирусных белков слияния – путь к предотвращению инфицирования клетки оболочечными вирусами (вирусы гепатитов В и С, вирусы гриппа, коронавирусы). Наше понимание принципов работы и эволюционного развития белков, специализирующихся на перестройке мембран, равно как и причин патологий, ассоциированных с нарушением работы этих белков или нарушением липидного гомеостаза, невозможно без количественного знания о пределе устойчивости/прочности липидного бислоя при изгибе, о характере его упругости при экстремальных значениях его геометрической кривизны; без представлений о молекулярных механизмах, ведущих к потери им структурной стабильности и роли липидного состава в этом процессе. В нашей лаборатории мы разрабатываем тест-систему для оценки изгибной прочности липидного бислоя, выявляем физические факторы, которые индуцируют потерю его структурной устойчивости при изгибе, и молекулярные пути его последующей топологической реорганизации и стараемся определить роль липидного состава и ионного окружения в данном процессе. Получаемые нами знания о фундаментальных свойствах липидного бислоя как материала имеют универсальный характер и, следовательно, являются важными для понимания работы любого белка, ответственного за морфогенез клеточных мембран. Определение связи между физико-химическими свойствами мембраны и молекулярными механизмами работы белков, ответственных за морфогенез клеточных мембран, равно как и определение траекторий структурной реорганизации липидного бислоя в норме и патологии необходимо для качественного перехода к персонализированной медицине и высокотехнологичному здравоохранению, когда речь идет о заболеваниях, ассоциированных с патологическими изменениями формы клеточных органелл.
На примере белка S (spike, белок шипа) вируса SARS-CoV-2 мы определяем детерминанты эффективности работы белков слияния/деления мембран, а именно пытаемся установить, какие именно изменения физико-химических свойств липидного бислоя должны быть индуцированы белками, чтобы вызвать его локальную дестабилизацию и структурную перестройку по заданному пути (с сохранением барьерных свойств липидного бислоя). Мы используем модельные системы слияния мембран с вирусоподобными частицами, собранными из структурных белков вируса SARS-CoV-2, для проведения рационального поиска потенциальных ингибиторов вирусного слияния среди природных полифенолов и коротких пептидов, способных растворяться в липидном бислое и, тем самым, оказывать влияние на его упругие и прочностные характеристики. В случае успеха мы сможем предложить новое стратегическое направление в поиске и разработке терапевтических средств, направленных на борьбу не только с SARS-CoV-2, но и с большим количеством других коронавирусов, в силу высокой консервативности пептидов слияния в них.
Разработка экспериментальной платформы для поиска антибиотиков нового поколения к лекарственно-устойчивому золотистому стафилококку
В рамках данного проекта создается суперпродуцент РНК полимеразы S. aureus на базе E. coli. Получение большого количества РНК полимеразы S. aureus необходимо для кристаллизации этого белка и решения его трёхмерной структуры с помощью рентгеноструктурного анализа. Данная система позволит получать комплексы РНК полимеразы S. aureus с низкомолекулярными соединениями, обладающими антимикробной активностью. Решение трёхмерных структур таких комплексов позволит осуществлять направленную разработку высокоспецифичных антибиотиков нового поколения активных в отношении золотистого стафилококка и родственных бактериальных патогенов.
Исследование механизмов транскрипционного мутагенеза у эукариот
Мутации, связанные с включением РНК полимеразой неправильных нуклеозидов, с некоторой частотой встречаются во всех клеточных РНК. Частота таких ошибок считается невысокой для общего пула РНК, однако для некоторых клеточных РНК доля молекул с мутациями может быть значительной. Известно, что точность транскрипции варьирует в зависимости от последовательности транскрибируемой ДНК и физиологического состояния клетки. Повышенная частота транскрипционных мутаций наблюдается при старении и, по крайней мере, некоторых видах рака. Повышенная частота транскрипционного мутагенеза ведет к развитию протеотоксического стресса в клетке и снижению её жизнеспособности. Молекулярный механизм мутагенеза при транскрипции последовательностей ДНК, где его частота наиболее высока, в настоящее время неизвестен. Использование методов криоэлектронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа позволит определить структурную основу транскрипционного мутагенеза. Это, в свою очередь, даст возможность изучить роль транскрипционного мутагенеза в клетках и животных, путём регуляции его интенсивности.
Создание сенсорных клеточных тест-систем in vitro
В рамках данного проекта создается суперпродуцент РНК полимеразы S. aureus на базе E. coli. Получение большого количества РНК полимеразы S. aureus необходимо для кристаллизации этого белка и решения его трёхмерной структуры с помощью рентгеноструктурного анализа. Данная система позволит получать комплексы РНК полимеразы S. aureus с низкомолекулярными соединениями, обладающими антимикробной активностью. Решение трёхмерных структур таких комплексов позволит осуществлять направленную разработку высокоспецифичных антибиотиков нового поколения активных в отношении золотистого стафилококка и родственных бактериальных патогенов.
Список основных публикаций сотрудников лаборатории
Galiakberova AA, Surin AM, Bakaeva ZV, Sharipov RR, Zhang D, Dorovskoy DA, Shakirova KM, Fisenko AP, Dashinimaev EB. IPSC-Derived Human Neurons with GCaMP6s Expression Allow In Vitro Study of Neurophysiological Responses to Neurochemicals. Neurochem Res. 2022 Apr;47(4):952-966. doi: 10.1007/s11064-021-03497-6. Epub 2021 Dec 2. PMID: 34855047; PMCID: PMC8891101.
Sorokina A, Artyuhov A, Goltsova A, Dashinimaev E. Detection of CCR5Δ32 Mutant Alleles in Heterogeneous Cell Mixtures Using Droplet Digital PCR. Front Mol Biosci. 2022 Feb 21; 9:805931. doi: 10.3389/fmolb.2022.805931. PMID: 35265670; PMCID: PMC8898955.
Bashkirov PV, Kuzmin PI, Lillo JV, Frolov VA. Molecular Shape Solution for Mesoscopic Remodeling of Cellular Membranes. Annu Rev Biophys. (2022) Feb 3. doi: 10.1146/annurev-biophys-011422-100054. Epub ahead of print. PMID: 35239417.
Ivchenkov D.V., Kuzmin P.I., Galimzyanov T.R., Shnyrova A.V., Bashkirov P.V., Frolov V.A. (2021) Nonlinear material and ionic transport through membrane nanotubes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes, Volume 1863, Issue 10
Bashkirov P.V., Kuzmin P.I., Chekashkina K., Arrasate P., Lillo J.V., Shnyrova A.V., & Frolov V.A. (2020). Reconstitution and real-time quantification of membrane remodeling by single proteins and protein complexes. Nature Protocols, 15(8), 2443-2469.
Bashkirov P.V., Chekashkina K.V., Shnyrova A.V., Frolov V.A. (2020) Electrophysiological Methods for Detection of Membrane Leakage and Hemifission by Dynamin 1. In: Ramachandran R. (eds) Dynamin Superfamily GTPases. Methods in Molecular Biology 2020, vol 2159. pp. 141-162
Galimzyanov, T.R., Bashkirov, P.V., Blank, P.S.Zimmerberg J.,Batishchev, O.V., Akimov, S.A. Monolayerwise application of linear elasticity theory well describes strongly deformed lipid membranes and the effect of solvent. Soft Matter, 2020, 16(5), pp. 1179-1189
Galiakberova AA, Dashinimaev EB. Neural Stem Cells and Methods for Their Generation From Induced Pluripotent Stem Cells in vitro. Front Cell Dev Biol. 2020 Oct 8;8:815. doi: 10.3389/fcell.2020.00815. PMID: 33117792; PMCID: PMC7578226.
Shakirova KM, Ovchinnikova VY, Dashinimaev EB. Cell Reprogramming With CRISPR/Cas9 Based Transcriptional Regulation Systems. Front Bioeng Biotechnol. 2020 Jul 28;8:882. doi: 10.3389/fbioe.2020.00882. PMID: 32850737; PMCID: PMC7399070.
Espadas J., Pendin D., Bocanegra R., Escalada A., Misticoni G., Trevisan T., Velasco-Olmo A., Montagna A., Bova S., Ibarra B., Kuzmin P.I., Bashkirov P.V., Shnyrova A.V., Frolov V.A., and Daga A. (2019) “Dynamic constriction and fission of endoplasmic reticulum membranes by reticulon” Nature Communication Nov 22;10(1):5327
Bassereau P., Jin R., Baumgart T., Deserno M., Dimova R., Frolov V. A., Bashkirov P.V., ... & Johannes L. (2018). The 2018 biomembrane curvature and remodeling roadmap. Journal of Physics D: Applied Physics, 51(34), 343001.
Efimova SS, Zakharova AA, Ismagilov AA, Schagina LV, Malev VV, Bashkirov PV, and Ostroumova OS. (2018). Lipid-mediated regulation of pore-forming activity of syringomycin E by thyroid hormones and xanthene dyes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1860(3), 691-699.
Dashinimaev EB, Artyuhov AS, Bolshakov AP, Vorotelyak EA, Vasiliev AV. Neurons Derived from Induced Pluripotent Stem Cells of Patients with Down Syndrome Reproduce Early Stages of Alzheimer's Disease Type Pathology in vitro. J Alzheimers Dis. 2017;56(2):835-847. doi: 10.3233/JAD-160945. PMID: 28059787.
Bashkirov P.V., Akimov S.A., Evseev A.I., Schmid S.L., Zimmerberg J., Frolov V.A. “GTPase cycle of dynamin is coupled to membrane squeeze and release, leading to spontaneous fission.” Cell, 2008, v. 135, No 7, pp. 1276-1286.