Лаборатория дизайна искусственных ферментов

Важной задачей синтетической биологии является модификация природных ферментов с целью улучшения их свойств или изменения субстратной специфичности, с последующим переходом к дизайну ферментов de novo.

Создание искусcтвенных ферментов de novo, под произвольную задачу – реакцию  или каскад ферментативных реакций  – является  амбициозной и захватывающей целью, к достижению которой уверенно приближаются различные научные коллективы, работающие в области синтетической биологии и белкового дизайна. Исключительная актуальность этого научного направления подчеркнута присвоением Нобелевской премии по химии 2024 года Дэвиду Бейкеру «за компьютерный дизайн белков» и Демису Хассабису и Джону Джамперу «за предсказание структуры белка».

Научные сотрудники Лаборатории дизайна искусственных ферментов НИИ СБМ Роспотребнадзора занимаются изучением свойств, мутагенезом и направленной эволюцией двух классов ферментов: 

1. ферменты нуклеинового обмена; 

2. протеазы.

Кроме того, в нашей лаборатории организованы и сосредоточены очень ресурсоемкие и наукоемкие технологические процессы, связанные с синтезом олигонуклеотидов и пептидных стандартов для протеомики.

Выполняемые работы и оборудование

Работы, выполняемые в лаборатории

• Высокопроизводительный синтез олигонуклеотидов.

• Очистка и пуллирование растворов олигонуклеотидов для дальнейшего использования в сборке генов ПЦР и клонированию по методу Гибсона.

• Синтез пептидов и пептидомиметиков произвольной сложности (преимущественно кислот и амидированных, но также с различными метками на C- и N- концах).

• Выделение, очистка и приготовление готовых форм пептидных стандартов.

• Оперативная аналитика и контроль качества и чистоты получаемых пептидов.

• Препаративная очистка пептидов методами твердофазной экстракции, обращенно-фазовой ВЭЖХ, ионообменной и эксклюзионной хроматографии.

• Синтез пептидных библиотек эпитопов для разработки пептидных вакцин.

• Синтез панелей меченных стабильными изотопами пептидных стандартов для целей протеомики.

Оборудование

• ВЭЖХ-МС система на базе тройного квадруполя Sciex 3500

• ВЭЖХ-УФ система Сканлаб

• 4-канальный пептидный синтезатор PurePep® Chorus (США).

• Система препаративной очистки пептидов среднего давления FPLC ÄKTA pure 25 производства Cytiva (США).

• Высокопроизводительный 768-канальный синтезатор ДНК и РНК олигонуклиотидов Dr. Oligo 768XLc - 2 x 384 производства Biolytic (США).

• 32 канальный синтезатор олигонуклеотидов ASM-32 производства БИОССЕТ

• Система автоматизированной очистки методом ТФЭ Tecan Resolvex A200

• Лиофильная настольная сушка для получения готовых форм FreeZone 2.5 Liter -84C производства Labconco (США).

• 2 лиофильные полочные сушки Labconco FreeZone 6L -50C

Научные интересы

• Мутагенез и дизайн ферментов, имеющих важное прикладное значение, с целью улучшения их характеристик.

• Системы искусственной эволюции для поиска новых вариантов ферментов.

• Синтез пептидомиметиков и разработка перспективных пептидных препаратов.

• Новые подходы к автоматизации и внедрению принципов зеленой химии в области пептидного синтеза.

• Создание новых пептидных векторов доставки радиоактивных изотопов для использования в ядерной медицине.

Дизайн ферментов

Ключевым объектом исследований в нашей лаборатории является терминальная деоксинуклеотидил трансфераза (TdT). Уникальная способность этого фермента осуществлять безматричный синтез ДНК делает его незаменимым в гипотетическом энзиматическом синтезе олигонуклеотидов. Для того, чтобы было возможным создать энзиматический синтезатор на TdT, необходимо осуществить глубокую модификацию фермента, повышающую его термостабильность, каталитическую активность, процессивность. Также необходимо изменить его субстратную специфичность таким образом, чтобы фермент мог работать с 3’-защищенными трифосфатами, для обратимой терминации присоединения. 

Поиск новых мутантных вариантом осуществляется посредством 

• итеративного насыщающего мутагенеза (ISM); 

• рационального дизайна, аугментированного инструментами ИИ (ProteinMPNN, Carbonara); 

• cистем искусственной эволюции в E. coli (с применением высокопроизводительного секвенирования и технологии FACS в будущем). 

Работы по созданию фермента ведутся параллельно с прототипированием энзиматического синтезатора олигонуклеотидов, в рамках выполнения обязательств по государственному заданию «Энзиматический синтезатор».  

В нашей лаборатории проводятся также исследования протеаз. Объектом нашего интереса является аспарагиновая эндопептидаза N1, которая входит в состав прекурсора белка капсида нового штамма нодавируса, обнаруженного в ходе работ в нашем институте. Предполагается профилирование ее активности и ее изменение ее свойств посредством итеративного насыщающего мутагенеза и методов искусственной эволюции.

Наконец, сотрудниками нашей лаборатории разрабатывается изотопно-меченый химерный белок (QCONCAT) для использования в количественных измерениях в клинической протеомике плазмы крови человека.

Пептидный синтез

Подгруппой синтеза нашей лаборатории организованы масштабные технологические процессы по производству больших панелей пептидов для скрининга, а также высоко-параллельное производство изотопно-меченых пептидных стандартов для целей протеомики. Хорошее приборное оснащение (пептидный синтезатор PurePep® Chorus, FPLC система AKTA 25 Pure, ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС системы, в том числе на базе Sciex 3500) позволяет нам осуществлять полный цикл получения панелей пептидных стандартов, в том числе меченых стабильными изотопами 13C и 15N для проведения протеомных исследований.

Пептидный синтез осуществляется в нашей лаборатории как твердофазным (SPPS), так и жидкофазным методом (LPPS). 

Новые подходы к автоматизации и внедрению принципов зеленой химии в области пептидного синтеза

Классический твердофазный синтез пептидов характеризуется большими расходами реагентов, в том числе токсичных растворителей, что идет вразрез с принципами зеленой химии и все повышающимися этическими требованиями и рекомендациями регуляторов к экологичности химических процессов.

Перенос методологии SPPS в двухфазные жидкие реакционные системы через применение новых растворимых в органической фазе носителей пептидной цепи позволит уменьшить избытки реагентов и заменить растворители на те, которые меньше угрожают окружающей среде.

Нами ведется разработка и внедрение гибридной технологии синтеза пептидов на липофильных якорях, которая объединяет в себе преимущества SPPS и LPPS.

Синтез пептидомиметиков и разработка перспективных пептидных препаратов

Хотя общая доля пептидов на рынке фармпрепаратов не очень велика (около 5%, и половина выручки – продажи инсулина), она стабильно растет на 7.7% каждые 10 лет. На начало 2021 года 80 пептидных препаратов было представлено на рынке, 150 находились в клинике и ~400–600 проходили предклинические испытания. Наверное, не будет большим преувеличением сказать, что будущее фармацевтики связано с пептидами.

Для решения проблем стабильности пептидов in vivo, отражающихся на фармакокинетике и биодоступности пептидных препаратов, необходимо совершенствовать структуру, создавая аналоги природных пептидов (например, посредством использования D-аминокислот) – пептидомиметики.

Нашей лабораторией ведутся работы по поиску антибактериальных пептидов и пептидомиметиков.

Наши работы по пептидным вакцинам включают в себя синтез библиотек эпитопов. Это перспективная и интенсивно развивающаяся в мире тематика, которая включает в себя разработку вакцин, применяющихся в борьбе против рака, SARS-CoV-2, болезни Альцгеймера.

Создание новых пептидных векторов доставки радиоактивных изотопов для использования в ядерной медицине

В нашей лаборатории есть большой методический задел по пептидным векторам доставки и их конъюгатам, используемым в ядерной медицине для терапии и диагностики широкого спектра заболеваний, а также для фотодинамической терапии. Пептидные препараты уже хорошо себя зарекомендовали в качестве специфичных и эффективных векторов доставки для целей ядерной медицины. В частности, ПЭТ/ОФЭКТ сканы стали неотъемлемой частью диагностики онкологических заболеваний и проведения терапии. Развитие направления связано с разработкой новых векторов доставки и разработкой эффективных комплексонов для технеция с использованием пептидомиметиков.

Синтез олигонуклеотидов и сборка генов

Второй важнейший технологический процесс, поставленный нашей лабораторией в институте -  высокопараллельный синтез олигонуклеотидов, для дальнейшего использования в сборке генов и протяженных генетических конструкций. В нашей группе введен в эксплуатацию 768-канальный синтезатор олигонуклеотидов Dr. Oligo 768XLc DNA RNA Synthesizer и АСМ-32 32 канальный синтезатор БИОССЕТ.

В зоне ответственности подгруппы олигонуклеотидного синтеза находится синтез, пуллирование, очистка и подготовка олигонуклеотидных библиотек под сборку генов 1-2kB методом ПЦР. 

Дальнейшая сборка, клонирование и секвенирование также рутинно осуществляется на базе или с непосредственным участием нашей лаборатории. 

Мы также имеем возможность производить зонды, праймеры под click-химию и прочие ДНК олигонуклеотиды с различными модификаторами.

В качестве долгосрочных задач планируется разработка аптамеров на биологические мишени а также использование аптамерных библиотек с целью поиска биомаркеров заболеваний.