Лаборатория биологии и медицины

研究方向

合成生物学

合成生物学的出现是生物体技术及其基本概念发展的结果从技术角度来看，合成生物学是基因工程发展的结果。基因工程通常涉及长度从数百到数千个碱基对的 DNA 分子的操作。同时，这样的DNA分子或者是天然的或者是天然DNA分子修饰的结果。在基因工程的框架内还开发了从头合成DNA序列的方法。

合成生物学首先需要一个高通量合成几千个碱基对的DNA延伸序列技术平台，其次需要一套方法学方法，可以将尺寸从几十到几十万碱基对的序列组装和传递到细胞中。这些技术节点中的每一个都有其自身的价值。

在科学、生物技术、诊断等领域所需的大多数蛋白质，都是通过长度为一千到几千个碱基对序列进行编码的。能够快速、大量生产此类序列的技术平台可用于： 1) 常规获取蛋白质生产者，如果需要获取广谱蛋白质来构建类自然的体外系统，2) 快速获取某种所需的蛋白质生产者，3)获得蛋白质变异库，例如抗体，4) 选择或搜索必要的特性。

能组装长度从数万到数十万个碱基对序列的技术节点，它可用于构建人工代谢途径，而这些途径又可被应用于生物技术中生产某种目标化合物，例如抗生素。

合成 DNA延伸序列技术也使得建立更为复杂的生物结构成为可能。例如，用于治疗细菌感染的噬菌体。

除了合成 DNA 延伸序列技术本身之外，还需要了解到底需要收集什么基础知识。技术节点是合成生物学的一部分，它使合理设计具有新活性的蛋白质成为可能，其中包括用于研究目的蛋白质，例如，荧光传感器或用于生物技术的具有新活性的酶。这里还包括有一个技术节点，它使合理设计代谢途径成为可能，其中包括考虑到人工代谢途径将在整个细胞代谢过程中发挥作用。同时还包括合理设计基因表达决定因素和被引入合成构建体的调控机制。

我们实验室正在开发合成DNA 延伸序列的方法。任何合成 DNA方法中的第一步都是利用化学方法合成寡核苷酸。接下来，通过酶促法将寡核苷酸连接到 DNA 序列中。这样获得大小为 1-2000 个碱基对的 DNA 片段，然后将这些序列分层拼接成更大的序列。

我们实验室已经创建了将目标序列分割成寡核苷酸的软件同时可以通过连接酶链式反应法或聚合酶链式反应法对合成分割进行优化。我们开发了将寡核苷酸酶拼接成 1000 个碱基对大小的 DNA 序列的方法，以及将此类片段拼接成几千个碱基对大小的序列的方法。

此外，我们实验室还开展了使用在DNA微距阵上合成的寡核苷酸酶来组装DNA序列的可能性研究。与标准亚磷酰胺柱方法相比，这种方法可以大大节省合成寡核苷酸的成本。在这种情况下，使用直接在DNA微阵列上获得的寡核苷酸库进行DNA合成是不可能的，因为这样的库包含种类繁多的寡核苷酸，而其中每种寡核苷酸的浓度都可以忽略不计。

为了解决这个问题，我们开发了一种富集靶向寡核苷酸亚库的方法：一个亚库设计组装一个片段。因此，并行寡核苷酸合成和组装被证明是可能的：一个DNA微矩阵可立即给出一个寡核苷酸库，使得从中合成大约十万个碱基对片段成为可能。下一步的工作涉及以下领域：寡核苷酸组装机器人化、开发寡核苷酸组装专用酶、开发十万个碱基对 DNA 片段组装并将其递送到细胞中的方法。

系统研究柔膜细菌模型最小细胞

柔膜细菌纲具有内共生细菌特有的基因组高度缩减的独特组合以及在营养介质上培养能力。这些特性的结合使柔膜细菌纲成为研究细胞功能基本原理的便捷模型。大多数已知的柔膜细菌纲是共生体或病原体，包括动物和人。柔膜细菌纲被分为几个系统发育类群，具有不同程度基因组缩减。基因组最高程度的缩减是支原体的特征。柔膜细菌纲的基因组高度缩减通常与它们在宿主中的寄生或共生生活方式有关，因为宿主的内部环境是稳定且营养丰富的。实验室的主要模型对象是鸡毒支原体。其他物体包括人型支原体 Mycoplasma hominis、莱氏无胆甾原体 Acholeplasma laidlawii 和蜜蜂螺原体 Spiroplasma melliferum。

此前，我们利用组学技术对柔膜细菌纲的分子组织进行了一系列研究。对莱氏无胆甾原体、蜜蜂螺原体和鸡毒支原体转录装置的组织进行了比较分析。进行了鸡毒支原体核糖体分析。开发了鸡毒支原体基因操作技术。

目前，实验室正在开展系统研究以下支原体模型最小细胞项目：

协调持家基因表达

由于基因组的显着缩减，柔膜细菌纲无论是在转录水平还是在翻译水平上，其特征是已知的（与其他生物体中已知的同源）基因表达调节系统缩减。支原体的特点是最大限度地缩减已知的基因表达调节系统。此外，包含我们在内的不同作者群在内的各个作者群组早些时候对扰动模型中支原体反应进行的研究表明，基因表达没有明显偏差，这与相应调节系统几近完全缩减一致。从根本上看，这表明如果外部条件稳定，不需要调节细胞基因表达。它只有在需要适应不断变化的环境条件时才有用。这种特殊情况下的例外仅仅是那些必须与宿主相互作用的支原体基因。

尽管如此，我们给自己设定了一项任务，即在鸡毒支原体模型上彻底证明或反驳关于支原体持家基因表达调节系统完全缩减的论点。为此，我们通过机器学习的方法，基于基因组序列构建了一个虚拟转录组计算模型。该模型使我们能够预测鸡毒支原体基因组中启动子活性的分布。通过比较鸡毒支原体基因组中虚拟的启动子活性和实验测量的启动子活性，发现所观察到的启动子活性与预测强度相差一个数量级或更多，无论是在更强或更弱的方面。这可以作为调节基因表达的新机制对这些启动子影响的间接标志。这些启动子还包括持家基因启动子，例如核糖体基因获得的数据经过实验验证，并发现了许多新的鸡毒支原体基因表达调节机制。还表明，许多高表达持家基因的特征是存在弱启动子甚至非功能性启动子与强大的激活剂的组合，这些激活剂将所得启动子活性提高1-2个数量级。因此，可以得出如下结论，调节最小细胞中的持家基因表达是必要的，但它的组织规律与对外部条件扰动的反应调节不同。特别地，对于核糖体蛋白操纵子rplJ的启动子而言，显示了相应核糖体蛋白表达和操纵子转录活性之间存在反馈环。进一步的工作包括确定一套持家基因表达调节机制，研究其作用机制以及协调其工作的原则。

支原体抗原成分定向进化机制

鸡毒支原体是一种寄生生物，具有一系列与宿主相互作用的机制其中一种机制是通过表面抗原的变异来逃避免疫反应。鸡毒支原体的主要表面膜蛋白是血凝素 VlhA。鸡毒支原体基因组包含几个编码 VlhA 血凝素不同变体的盒。血凝素基因总数有几十个，不同菌株间差异较大。研究人员此前已经证明，每一瞬间仅表达一个基因，活跃表达与相应基因启动子中12个GAA重复序列的存在有关。相互矛盾的现有文献数据表明，主动表达的血凝素转换可以自发发生，也可以在用针对当前表达的血凝素抗体加工后发生。同时，病原体抗原自发转换的例子有很多。抗原组成的自发变化是逃避免疫反应的最常见方法之一，在其他类型的支原体中也发现了这种机制。因此，根据文献数据，我们可以假设血凝素VlhA的表达转换是自发的，并且抗体的存在只会增加其频率。我们也可假设这种转换不是自发产生的，而是根据某种逃避免疫反应方式的优化算法。当鸡毒支原体的几种克隆培养物独立地从一种特定的血凝素（对于所有的血凝素都一样的）转换为另一种特定的血凝素（并且对于几十个可能的血凝素中的所有血凝素也都一样的）时，我们的假设得到了证实结果表明，天然 DNA 编辑发生在 vlhA 基因的启动子区域。重复次数依次从 13 到 10 变化，每次免疫攻击减少 1 次重复。如果重复次数为12，则基因被激活。如果重复次数达到10次，则在下一阶段恢复为13次。因此，在整个群体中实现了抗原转换的同步性，并且细胞无法接触宿主免疫反应的时间增加了。我们已经确定负责所述调节的蛋白质。相应的蛋白质复合物是一种跨膜蛋白质复合物。其外表部分与当前活跃表达的血凝素相关，而细胞质部分则与编码该血凝素的基因启动子相关。因此，这种复合物确保了表型和基因型的关联。进一步的工作涉及确定 DNA 编辑系统并阐明调节复合物的运作机制。

研究方法

基因合成。实验室开发了两种合成多达一千个碱基对的DNA序列的方法：连接酶链式反应法和聚合酶链式反应法。无论哪种情况，第一步都是使用实验室开发的软件将目标DNA序列分解为寡核苷酸。寡核苷酸可以通过任何方法合成。使用上述方法中的一种方法进行寡核苷酸的酶促组装。再进行酶促纠错阶段。此后，利用Gibbson 体外同源反应法将序列转移到载体上。
基因组学和转录组学。 实验室开发了利用各种测序平台进行细菌转录分析的方法。已开发出一种利用双链体特异性核酸酶使文库中 cDNA 表示标准化的方法。一种精确的全基因组转录起始点作图方法已开发出来。已开发出一种用于核糖体相关 mRNA 转录分析的方法。已开发出用于鸡毒支原体转录分析的 DNA 微矩阵设计。

该实验室还在开发基因操作方法和研究模型对象——鸡毒支原体的工具。已开发了一种用于鸡毒支原体遗传转化和蛋白质表达的高效转座子载体。已开发出基于 dCas9 蛋白的鸡毒支原体基因敲低系统。针对鸡毒支原体（基于蛋白质 LacZ、YFP、mMaple2）开发了报告和传感系统。尤其是开发了丙酮酸荧光传感器。
重组蛋白的生产。实验室进行大肠杆菌蛋白质表达载体组装，并使用金属螯合色谱法生产重组蛋白质。
生物信息学。 实验室开发系统生物学、基因组学和转录组学的软件。已开发出一种模型，可以基于机器学习按照基因组序列来预测柔膜细菌纲基因转录活性。

发表的作品

Evsyutina DV, Semashko TA, Galyamina MA, Kovalchuk SI, Ziganshin RH, Ladygina VG, Fisunov GY, Pobeguts OV. Molecular Basis of the Slow Growth of Mycoplasma hominis on Different Energy Sources. Front Cell Infect Microbiol. 2022, https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.918557
Evsyutina DV, Fisunov GY, Pobeguts OV, Kovalchuk SI, Govorun VM. Gene Silencing through CRISPR Interference in Mycoplasmas. Microorganisms 2022, 10(6), 1159; https://doi.org/10.3390/microorganisms10061159
Fisunov GY, Zubov AI, Pobeguts OV, Varizhuk AM, Galyamina MA, Evsyutina DV, Semashko TA, Manuvera VA, Kovalchuk SI, Ziganshin RK, Barinov NA, Klinov DV, Govorun VM. The Dynamics of Mycoplasma gallisepticum Nucleoid Structure at the Exponential and Stationary Growth Phases. Front Microbiol. 2021, 12:753760. doi: 10.3389/fmicb.2021.753760.
Veselovsky VA, Dyachkova MS, Menyaylo EA, Polyaeva PS, Olekhnovich EI, Shitikov EA, Bespiatykh DA, Semashko TA, Kasianov AS, Ilina EN, Danilenko VN, Klimina KM. Gene Networks Underlying the Resistance of Bifidobacterium longum to Inflammatory Factors. Front Immunol. 2020 Nov 16;11:595877. doi: 10.3389/fimmu.2020.595877.
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