Лаборатория системного анализа микроорганизмов

Направления исследований

Синтетическая биология

Синтетическая биология появилась в результате развития как технологий, так и фундаментальных представлений о живых организмах. С точки зрения технологий синтетическая биология является результатом развития генной инженерии. Генная инженерия, как правило, предполагает манипуляции молекулами ДНК длиной от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований. При этом такие молекулы ДНК являются либо природными, либо результатом модификации природных молекул ДНК. В рамках генной инженерии также развивались методы синтеза последовательностей ДНК de novo.

Синтетическая биология предполагает, во-первых, технологическую платформу для высокопроизводительного синтеза протяжённых последовательностей ДНК размером несколько тысяч пар оснований. Во-вторых, набор методических подходов, позволяющих собирать и доставлять в клетки последовательности размером от нескольких десятков до нескольких сотен тысяч пар оснований. Каждый из этих технологических узлов имеет и самостоятельную ценность.

Большинство белков, востребованных в науке, биотехнологии, диагностике и т.д., кодируются последовательностями длиной от тысячи до нескольких тысяч пар оснований. Технологическая платформа, позволяющая быстро и в больших количествах производить такие последовательности может использоваться для рутинного получения продуцентов белков, в случае если: нужно получить широкий спектр белков для конструирования природоподобных систем in vitro, для быстрого получения продуцента какого-либо требуемого белка, для получения библиотек вариантов белков, например, антител, для подбора или поиска необходимых свойств.

Технологический узел, позволяющий осуществлять сборку последовательностей длиной от десятков до сотен тысяч пар оснований, может использоваться для конструирования искусственных метаболических путей, используемых в свою очередь в биотехнологии для получения каких-либо целевых соединений, например, антибиотиков.

Технологии синтеза протяжённых последовательностей ДНК также позволяют создавать более сложные биологические структуры. Например, бактериофаги для терапии бактериальных инфекций.

Помимо непосредственно технологий синтеза протяжённых последовательностей ДНК требуются также фундаментальные знания о том, что именно нужно собирать. Частью синтетической биологии является технологический узел, позволяющий осуществлять рациональный дизайн белков, обладающих новыми активностями, в том числе для исследовательских целей, например, флуоресцентных сенсоров, или ферментов с новыми активностями для биотехнологии. Также сюда относится технологический узел, позволяющий создавать рациональный дизайн метаболических путей, в том числе с учётом того, что искусственные метаболические пути будут функционировать в контексте всего метаболизма клетки. Сюда же относится рациональный дизайн детерминантов экспрессии генов и механизмов регуляции, внедряемых в синтезируемые конструкции.

Наша лаборатория ведёт разработку методов синтеза протяжённых последовательностей ДНК. Первым этапом синтеза ДНК при любом подходе является синтез олигонуклеотидов химическим способом. Далее происходит сшивка олигонуклеотидов в последовательность ДНК ферментативным способом. Таким методом получаются фрагменты ДНК размером 1-2 тысячи пар оснований. Затем эти последовательности иерархически сшиваются в последовательности всё более крупного размера.

В нашей лаборатории создано программное обеспечение, осуществляющее разбиение целевой последовательности на олигонуклеотиды. При этом возможна оптимизация разбиения для синтеза методом лигазной цепной реакции или полимеразной цепной реакции. Нами разработаны методы ферментативного сшивания олигонуклеотидов в последовательности ДНК размером 1000 пар оснований и методы сшивания таких фрагментов в последовательность размером несколько тысяч пар оснований.

Кроме того, в нашей лаборатории проведена работа по исследованию возможности использования олигонуклеотидов, синтезированных на ДНК-микроматрицах, для сборки последовательностей ДНК. Такой подход позволяет сильно экономить на стоимости синтеза олигонуклеотидов по сравнению со стандартным колоночным фосфорамидитным методом. При этом использовать пул олигонуклеотидов непосредственно полученных на ДНК-микроматрице для синтеза ДНК использовать невозможно, т.к. такой пул содержит слишком большое разнообразие олигонуклеотидов, каждый из которых представлен в ничтожной концентрации. Для решения этой проблемы мы разработали метод обогащения целевых субпулов олигонуклеотидов: один субпул рассчитан на сборку одного фрагмента. Таким образом, оказалось возможно распараллелить синтез и сборку олигонуклеотидов: одна ДНК-микроматрица сразу даёт пул олигонуклеотидов, позволяющий синтезировать из неё фрагмент порядка ста тысяч пар оснований.

Дальнейшая работа предполагает следующие направления: роботизация сборки олигонуклеотидов, разработка собственных ферментов для сборки олигонуклеотидов, разработка методов сборки фрагментов ДНК размером порядка ста тысяч пар оснований и доставки их в клетку.

Системное исследование минимальной клетки на модели бактерий класса Молликут

Бактерии класса Молликут обладают уникальным сочетанием высокой степени редукции генома, характерной для бактерий-эндосимбионтов, и способностью культивироваться на питательных средах. Сочетание этих свойств делает Молликут удобной моделью для исследования базовых принципов функционирования клетки. Большинство известных представителей Молликут являются комменсалами или патогенами, в том числе животных и человека. Молликуты делятся на несколько филогенетических групп с разной степенью редукции генома. Наибольшая степень редукции генома характерна для микоплазм. Высокая степень редукции генома у Молликут обычно связывается с их паразитическим или комменсальным образом жизни в организме хозяина, поскольку внутренняя среда организма хозяина гомеостатирована и богата питательными веществами. Основным модельным объектом лаборатории является Mycoplasma gallisepticum. Также другими объектами являются Mycoplasma hominis, Acholeplasma laidlawii и Spiroplasma melliferum.

Ранее нами был проведён цикл исследований молекулярной организации Молликут с помощью омиксных технологий. Был проведён сравнительный анализ организации транскрипционного аппарата у A. laidlawii, S. melliferum, M. gallsiepticum. Было проведено рибосомное профилирование M. gallisepticum. Были разработаны технологии генетических манипуляций с M. gallisepticum.

В настоящий момент лаборатория занимается следующими проектами по теме системного исследования минимальной клетки на модели микоплазм:

Координация экспрессии генов домашнего хозяйства

В силу значительной редукции генома для Молликут характерна редукция известных (гомологичных известным у других организмов) систем регуляции экспрессии генов, как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Микоплазмы характеризуются максимальной степенью редукции известных систем регуляции экспрессии генов. Также, проведённые ранее разными группами авторов (в том числе нашей) исследования ответа микоплазм в пертурбационных моделях показали отсутствие существенных отклонений в экспрессии генов, что согласуется с почти полной редукции соответствующих регуляторных систем. С фундаментальной точки зрения это говорит о том, что регуляция экспрессии генов клетке, в целом, не нужна если внешние условия постоянны. Она может быть полезной только при необходимости подстраиваться под непрерывно меняющиеся условия внешней среды. Исключение в данном частном случае микоплазм составляют только гены, необходимые для взаимодействия с хозяином.

Тем не менее, мы поставили перед собой задачу исчерпывающе доказать или опровергнуть тезис о тотальной редукции систем регуляции экспрессии генов домашнего хозяйства у микоплазм на модели M. gallisepticum. Для этого нами была построена модель расчёта виртуального транскриптома на основе последовательности генома методом машинного обучения. Наша модель позволила предсказывать распределение активности промоторов в геноме M. gallisepticum. В результате сравнения виртуальной и экспериментально измеренной активности промоторов в геноме M. gallisepticum были обнаружены промоторы, наблюдаемая активность которых отличалась от предсказанной силы на порядок и более как в большую, так и в меньшую стороны. Это могло служить косвенным признаком воздействия на эти промоторы новых механизмов регуляции экспрессии генов. В число таких промоторов вошли также промоторы генов домашнего хозяйства, например, рибосомных генов. Полученные данные были экспериментально проверены и был обнаружен ряд новых механизмов регуляции экспрессии генов у M. gallisepticum. Также было показано, что для ряда высоко экспрессирующихся генов домашнего хозяйства характерно наличие слабых или даже нефункциональных промоторов в сочетании с мощными активаторами, увеличивающими результирующую активность промотора на 1-2 порядка. Таким образом, можно сделать вывод о том, что регуляция экспрессии генов домашнего хозяйства в минимальной клетке необходима, но устроена она по иным законам, нежели регуляция ответа на пертурбации внешних условий. В частности, для промотора оперона рибосомных белков rplJ было показано наличие петли обратной связи между экспрессией соответствующих рибосомных белков и транскрипционной активностью оперона. Дальнейшая работа предполагает выявление набора механизмов регуляции экспрессии генов домашнего хозяйства, изучение механизма их действия и принципов, по которым происходит координация их работы.

Механизм направленной эволюции антигенного состава микоплазм

Mycoplasma gallisepticum, будучи паразитическим организмом, имеет ряд механизмов для взаимодействия с хозяином. Одним из таких механизмов является уход от иммунного ответа с помощью вариабельности поверхностных антигенов. Основным поверхностным белком мембраны M. gallisepticum является гемагглютинин VlhA. В геноме M. gallisepticum присутствуют несколько кассет, кодирующих разны варианты гемагглютининов VlhA. Суммарно число генов гемагглютининов составляет несколько десятков и варьирует у разных штаммов. Ранее исследователями было показано, что только один ген экспрессируется в каждый момент времени, причём активная экспрессия сопряжена с наличием 12 повторов GAA в промоторе соответствующего гена. Существующие противоречивые литературные данные свидетельствуют о том, что переключение активно экспрессирующегося гемагглютинина может происходить как спонтанно, так и при обработке антителами против того гемагглютинина, который экспрессируется в данный момент. При этом примеров спонтаного переключения антигенов у патогенов множество. Спонтанное изменение антигенного состава один из наиболее распространённых способов ухода от иммунного ответа, причём среди других видов микоплазм такие механизмы тоже были обнаружены. Таким образом, исходя из литературных данных, можно было бы предположить, что и экспрессия гемагглютининов VlhA переключается спонтанно, а наличие антител лишь увеличивает его частоту. Мы же предположили, что переключение происходит не спонтанно, а по определённому алгоритму, который занимается оптимизацией пути ухода от иммунного ответа. Наша гипотеза была подтверждена, когда несколько клональных культур M. gallisepticum независимо друг от друга переключались с одного определённого гемагглютинина (одинакового для всех) на другой определённый (и также одинаковый для всех из нескольких десятков возможных). В результате было показано, что происходит природное редактирование ДНК в промоторной зоне генов vlhA. Число повторов GAA меняется от 13 до 10 последовательно с декрементом в 1 повтор за одну иммунную атаку. Если число повторов равно 12, ген активируется. Если число повторов достигает 10, то на следующем этапе оно восстанавливается до 13. За счёт этого достигается синхронность переключения антигенов во всей популяции, и увеличивается время, в течении которого клетки остаются недоступными для иммунного ответа хозяина. Нами были выявлены белки, отвечающие за описанную регуляцию. Соответствующий белковый комплекс является трансмембранным. Наружная его часть связана с текущим активно экспрессирующимся гемагглютинином, а цитоплазматическая часть с промотором гена, кодирующего этот гемагглютинин. Таким образом, комплекс обеспечивает сопряжение фенотипа и генотипа. Дальнейшая работа связана с выявлением системы редактирования ДНК и выяснения механизма работы регуляторного комплекса.

Методы

• Синтез генов. В лаборатории разработаны два способа синтеза последовательностей ДНК размером до тысячи пар оснований: методом лигазной цепной реакции и методом полимеразной цепной реакции. В любом случае на первом шаге целевая последовательность разбивается на олигонуклеотиды с помощью разработанного в лаборатории программного обеспечения. Олигонуклеотиды могут быть синтезированы любым способом. Затем происходит ферментативная сборка олигонуклеотидов одним из вышеописанных способов. Затем проводится этап ферментативной коррекции ошибок. После этого последовательность переносится в вектор методом in vitro гомологичной реакции по Гиббсону.
• Геномика и транскриптомика. В лаборатории разработаны методы транскрипционного профилирования бактерий с использованием различных платформ для секвенирования. Разработан метод нормализации представленности кДНК в библиотеках с помощью дуплекс-специфической нуклеазы. Разработан метод точного полногеномного картирования точек инициации транскрипции. Разработан метод транскрипционного профилирования рибосом-ассоциированной мРНК. Разработан дизайн ДНК-микроматрицы для транскрипционного профилирования M. gallisepticum.
  
  Также в лаборатории проводится разработка методов для генетических манипуляций и инструментов для исследования модельного объекта – Mycoplasma gallisepticum. Был разработан эффективный транспозонный вектор для генетической трансформации и экспрессии белков в M. gallisepticum. Была разработана система для генетического нокдауна в M. gallisepticum на основе белка dCas9. Были разработаны репортерные и сенсорные системы для M. gallisepticum (на основе белков LacZ, YFP, mMaple2). В частности, флуоресцентный сенсор пирувата.
• Получение рекомбинантных белков. В лаборатории проводится сборка векторов для экспрессии белков в E. coli и получение рекомбинантных белков методом металл-хелатной хроматографии.
• Биоинформатика. В лаборатории проводится разработка программного обеспечения для системной биологии, геномики и транскриптомики. Разработана модель, предсказывающая транскрипционную активность геномов Молликут исходя из их последовательности на основе машинного обучения.

Публикации

• Evsyutina DV, Semashko TA, Galyamina MA, Kovalchuk SI, Ziganshin RH, Ladygina VG, Fisunov GY, Pobeguts OV. Molecular Basis of the Slow Growth of Mycoplasma hominis on Different Energy Sources. Front Cell Infect Microbiol. 2022, https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.918557

• Evsyutina DV, Fisunov GY, Pobeguts OV, Kovalchuk SI, Govorun VM. Gene Silencing through CRISPR Interference in Mycoplasmas. Microorganisms 2022, 10(6), 1159; https://doi.org/10.3390/microorganisms10061159

• Fisunov GY, Zubov AI, Pobeguts OV, Varizhuk AM, Galyamina MA, Evsyutina DV, Semashko TA, Manuvera VA, Kovalchuk SI, Ziganshin RK, Barinov NA, Klinov DV, Govorun VM. The Dynamics of Mycoplasma gallisepticum Nucleoid Structure at the Exponential and Stationary Growth Phases. Front Microbiol. 2021, 12:753760. doi: 10.3389/fmicb.2021.753760.

• Veselovsky VA, Dyachkova MS, Menyaylo EA, Polyaeva PS, Olekhnovich EI, Shitikov EA, Bespiatykh DA, Semashko TA, Kasianov AS, Ilina EN, Danilenko VN, Klimina KM. Gene Networks Underlying the Resistance of Bifidobacterium longum to Inflammatory Factors. Front Immunol. 2020 Nov 16;11:595877. doi: 10.3389/fimmu.2020.595877.

• Komarova ES, Chervontseva ZS, Osterman IA, Evfratov SA, Rubtsova MP, Zatsepin TS, Semashko TA, Kostryukova ES, Bogdanov AA, Gelfand MS, Dontsova OA, Sergiev PV. Influence of the spacer region between the Shine-Dalgarno box and the start codon for fine-tuning of the translation efficiency in Escherichia coli. Microb Biotechnol. 2020 Jul;13(4):1254-1261. doi: 10.1111/1751-7915.13561.

• Pobeguts OV, Ladygina VG, Evsyutina DV, Eremeev AV, Zubov AI, Matyushkina DS, Scherbakov PL, Rakitina DV, Fisunov GY. Propionate Induces Virulent Properties of Crohn's Disease-Associated Escherichia coli. Front Microbiol. 2020 Jul 8;11:1460. doi: 10.3389/fmicb.2020.01460.

• Kornienko M, Fisunov G, Bespiatykh D, Kuptsov N, Gorodnichev R, Klimina K, Kulikov E, Ilina E, Letarov A, Shitikov E. Transcriptional Landscape of Staphylococcus aureus Kayvirus Bacteriophage vB_SauM-515A1. Viruses 2020 Nov 17;12(11):1320. doi: 10.3390/v12111320.

• Garanina IA, Fisunov GY, Govorun VM. BAC-BROWSER: The Tool for Visualization and Analysis of Prokaryotic Genomes. Front Microbiol. 2018 Nov 21;9:2827. doi: 10.3389/fmicb.2018.02827.

• Orlov M, Garanina I, Fisunov GY, Sorokin A. Comparative Analysis of Mycoplasma gallisepticum vlhA Promoters. Front Genet. 2018 Nov 21;9:569. doi: 10.3389/fgene.2018.00569.

• Butenko I, Vanyushkina A, Pobeguts O, Matyushkina D, Kovalchuk S, Gorbachev A, Anikanov N, Fisunov G, Govorun V. Response induced in Mycoplasma gallisepticum under heat shock might be relevant to infection process. Sci Rep. 2017 Sep 12;7(1):11330. doi: 10.1038/s41598-017-09237-7.

• Fisunov GY, Evsyutina DV, Manuvera VA, Govorun VM. Binding site of restriction-modification system controller protein in Mollicutes. BMC Microbiol. 2017 Jan 31;17(1):26. doi: 10.1186/s12866-017-0935-4.

• Fisunov GY, Evsyutina DV, Semashko TA, Arzamasov AA, Manuvera VA, Letarov AV, Govorun VM. Binding site of MraZ transcription factor in Mollicutes. Biochimie 2016 Jun;125:59-65. doi: 10.1016/j.biochi.2016.02.016.

• Fisunov GY, Evsyutina DV, Garanina IA, Arzamasov AA, Butenko IO, Altukhov IA, Nikitina AS, Govorun VM. Ribosome profiling reveals an adaptation strategy of reduced bacterium to acute stress. Biochimie 2017 Jan;132:66-74. doi: 10.1016/j.biochi.2016.10.015.

• Fisunov GY, Garanina IA, Evsyutina DV, Semashko TA, Nikitina AS, Govorun VM. Reconstruction of Transcription Control Networks in Mollicutes by High-Throughput Identification of Promoters. Front Microbiol. 2016 Dec 6;7:1977. doi: 10.3389/fmicb.2016.01977.

• Mazin PV, Fisunov GY, Gorbachev AY, Kapitskaya KY, Altukhov IA, Semashko TA, Alexeev DG, Govorun VM. Transcriptome analysis reveals novel regulatory mechanisms in a genome-reduced bacterium. Nucleic Acids Res. 2014 Dec 1;42(21):13254-68. doi: 10.1093/nar/gku976.

• Vanyushkina AA, Fisunov GY, Gorbachev AY, Kamashev DE, Govorun VM. Metabolomic analysis of three Mollicute species. PLoS One. 2014 Mar 4;9(3):e89312. doi: 10.1371/journal.pone.0089312.

• Gorbachev AY, Fisunov GY, Izraelson M, Evsyutina DV, Mazin PV, Alexeev DG, Pobeguts OV, Gorshkova TN, Kovalchuk SI, Kamashev DE, Govorun VM. DNA repair in Mycoplasma gallisepticum. BMC Genomics. 2013 Oct 23;14:726. doi: 10.1186/1471-2164-14-726.

• Fisunov GY, Alexeev DG, Bazaleev NA, Ladygina VG, Galyamina MA, Kondratov IG, Zhukova NA, Serebryakova MV, Demina IA, Govorun VM. Core proteome of the minimal cell: comparative proteomics of three mollicute species. PLoS One. 2011;6(7):e21964. doi: 10.1371/journal.pone.0021964.

Разработанное программное обеспечение

Нами создано программное обеспечение для работы с последовательностями геномов и векторов, дизайна нуклеотидных последовательностей и разбиения их на олигонуклеотиды для последующего синтеза, а также для просмотра и анализа транскриптомных данных.

Программу можно скачать по ссылке  BAC-browser 2.1